조직 학적 및 기능적 특성 : Methylnitrosourea (MNU)는 망막 변성과 재생 제브라 피쉬에서 유도 된
Summary
여기에서 우리는 망막 있도록 지연 및 재생과 성인 제브라 피쉬에서 N 메틸 N의 -nitrosourea을 사용하여 시각 기능에 미치는 영향의 정량화를 보여줍니다. 시력의 손실 및 감소 감광체 번호는 내부 핵 층에 확산하여 관찰 하였다. 완전한 형태 학적 및 기능적 재생은 30 일 초기 치료 후 발생했습니다.
Abstract
산업계에서 시력 손실의 대부분 감광체 손상 계정 얻어진 망막 퇴행성 질환, 예를 들면 색소 성 망막염,. 동물 모델은 질병을 연구하는 중요한 중요하다. 이 점에있어서의 N – 메틸 – N -nitrosourea (MNU)가 설치류에서 널리 사용되어왔다 감광체 특정 독소는 약리 망막 변성을 유도한다. 이전에, 우리는 제브라 피쉬의 MNU에 의한 망막 변성 모델, 시각 연구에서 또 다른 인기 모델 시스템을 설립했다.
포유 동물 매혹적인 차이는 성인 zebrafish의 망막 손상 후의 재생의 지속적인 신경이다. 우리는 성인 zebrafish의 시력 측정을 채용 한이 관찰을 정량화합니다. 이로써, optokinetic 휘어진 비 마취 물고기 기능적 변화를 수행하는 데 사용되었다. 이것은 면역 staini뿐만 아니라 조직 학적으로 보충 하였다세포 사멸에 대한 NG (TUNEL) 및 확산 (PCNA)의 개발 형태 학적 변화의 상관 관계를합니다.
요약하면, 광 수용체 세포 자멸 사흘 외부 핵 층 (ONL)에서 세포의 현저한 감소로 이어진다 MNU 치료 후 발생한다. 그 후, 내부 핵 층 (INL)와 ONL에서 세포의 증식이 관찰된다. 여기서, 우리는 완전한 조직 학적뿐만 아니라 또한 재생 기능 30 일의 시간을 걸쳐 발생하는 것을 알 수있다. 이제 우리는 정량화 및 비디오 형식으로 MNU를 사용하여 제브라 피쉬의 망막 있도록 지연 및 재생을 수행하는 방법을 설명한다.
Introduction
비전은 인간의 가장 중요한 감각과 손상은 높은 사회 경제적 영향을 미친다. 선진국에서는 망막 퇴행성 질환은 노인 1 중 시력 손실과 실명의 주요 원인이다. 대부분의 퇴행성 망막 질환의 원인은 부분적으로 만 이해하고 치료 적 솔루션은 잃어버린 시력을 회복하는 것은 매우 제한되어 있습니다. 색소 성 망막염이 N의 -nitrosourea (MNU) 망막 변성을 유도를 메틸 차 감광체 손실 2-3. N과 망막 퇴행성 질환의 전형적인 예이고 따라서 광범위 일차 시각 세포 사멸 4 질환을 모델링 설치류에서 사용된다. 그것은 알킬화제이며 일반적으로 노출 5-7 후 몇 개월을 나타 양성과 악성 종양으로 이어집니다. 또한, 단기간의 관찰 기간 내에 특정 시각 세포 사멸시킨다. 이로써, 망막 층 structu의 손실다시 상당한 망막 박화는 농도 의존적 방식으로 관찰되었다. 망막 글 리아 세포는 활성화되었지만, 망막 색소 상피 세포 (RPE)의 변경이 발견되지 않음. 소포체 (ER) 스트레스와 관련된 세포 사멸은 망막 8 MNU 조치의 주요 통로가 될 것으로 보인다.
우리는 최근에 제브라 피쉬 구에서 광 수용체의 변성을 유도하는 화학 모델로 MNU를 도입했습니다. 다른 이유의 사이에, 제브라 피쉬 (다니오 rerio)가 있기 때문에 다른 척추 동물 (10)의 그것의 시각 시스템의 유사성 시각 연구에 중요 해지고있다. 외부 망막은 자외선, 짧은, 중간에 피크 감도, 가시 스펙트럼의 장파장 한로드 광 수용체의 유형 네 가지 콘 유형으로 분류 될 수있는 광 수용체를 포함하고 있습니다. 내부 핵 계층 (INL)에서, 바이폴라, 수평 및 무 축삭의 interneurons의 세포 기관은 아 같이 발견뮐러 글 리아 세포의 세포 소마 같은 리터. 외측 얼기 층 (OPL)에서 감광체와 내측 망막 사이의 연접은 렌즈에 가장 가까운 세포층 반면 시신경 및 시신경 요로로 이루어지는 긴 축삭을 형성 성분 신경절 세포 층 (GC)이다 형성된 . 신경절 세포 및 내부 핵 층에있는 세포 간의 연접은 내측 얼기 층 (IPL) (11)에 형성된다. RPE는 감각 신경 망막의 외측에있는 긴 혀끝의 미세 융모 (12) 감광체 외부 세그먼트를 둘러싼 다. 또한, 제브라 피쉬는 매우 회생 및 병변 뇌, 망막, 척수, 심장, 및 기타 조직 (13)를 다시 자라게 할 수 있습니다. 망막 손상이 발생하면, 뮐러 세포 것으로 생각된다 INL에서 세포 활성화 및 각종 망막 세포 유형으로 분화 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 또한, 그들은 또한 ONL에있는로드 전구 세포를 생성한다. 또 이렇게새로운 세포로 성인 제브라 피쉬의 망막을 공급, 나아가이 섬모 한계 영역입니다. 이 소스는 연속적으로 성장하는 피쉬 아이 (14)에로드 감광체의 일정한 밀도를 달성하기 위해 필요하다.
MNU 모델은 망막 조직에 대한 단순하고 재현성 퇴화 / 재생 방법으로 사용될 수있다. 때문에 제브라 피쉬의 생물학적 과정의 특정 유사성과 인간이 관여 세포 사멸 경로를 확인하기 위해 문을 열 수있는 잠재적 신경 보호 약물을 선별. 우리 그룹에서 이전의 연구를 바탕으로, 우리는 지금 망막 있도록 지연 및 실험실 동영상 구에 따라 기능적인 변화를 포함 필연적 재생이 MNU 유도 제브라 피쉬 모델의 방법을 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이전에, 우리 그룹은 제브라 피쉬의 시스템 구에 설치류에서 시세포 변성의 MNU 모델을 전송하고있다. 계속되는 이벤트 설명 및 최대 30 일 동안 추적 관찰 하였다. 이 기간에 완전한 형태의 망막 변성 및 재생이 초기 치료 후 발생. 첫째, 조직 학적가 감소 된로드 셀 상응 일 8에서 최소에 일 3에서 계산 계시, TUNEL 염색 삼일 MNU 처리 후로드 광 수용체의 세포 사멸을 식별합니다. 재생은 증식 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Monika Kilchenmann, Federica Bisignani and Agathe Duda for their excellent technical assistance.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
| Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| TrizmaÒ base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).
- Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura, T., Usui, Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities. J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).
- Morton, D., et al. N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies. Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).
- Terracini, B., Testa, M. C. Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats. 24, 588-598 (1970).
- Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).
- Tappeiner, C., et al. Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU). PLOS One. 12, (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).
- Fleisch, C., Neuhauss, S. Visual Behavior in Zebrafish. Zebrafish. 3, 191-201 (2006).
- Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina. InterScience. 288, 653-662 (2006).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
- Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
- Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9 (1), 10 (2012).
- Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).
- Nelson, C. M., Hyde, D. R. Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish. J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).
- Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in. Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
