Methylnitrosourea (MNU) -induced רשתית ניוון והתחדשות בדג הזברה: היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים
Summary
במסמך זה אנו מדגימים כימות של דה ברשתית והתחדשות והשפעתה על תפקוד ראייה באמצעות -nitrosourea N -methyl- N בדג הזברה המבוגר. מספרי קולטי אור אובדן של חדות ראייה והירידה היו במעקב על ידי התפשטות בשכבת הגרעין הפנימית. התחדשות מורפולוגית ופונקציונלית מלאה התרחשה 30 ימים לאחר הטיפול הראשוני.
Abstract
מחלות רשתית ניווניות, רטיניטיס פיגמנטוזה למשל, עם וכתוצאה מכך חשבון נזק קולטי אור עבור רוב אובדן הראייה בעולם התעשייתי. מודלים של בעלי החיים הם בעלי חשיבות מכרעת ללימודי מחלות כגון. בהקשר זה רעלן קולטי האור ספציפי -nitrosourea N -methyl- N (MNU) כבר בשימוש נרחב במכרסמים כדי לגרום פרמקולוגית ניוון רשתית. בעבר, הקמנו מודל מושרה MNU רשתית ניוון בדג הזברה, עוד מערכת מודל פופולרית במחקר חזותי.
הבדל מרתק ליונקים הוא נוירוגנזה המתמשכת ברשתית דג הזברה מבוגרת והתחדשותו לאחר פגיעה. כדי לכמת תצפית זו יש לנו עובדי מדידות חדות ראייה בדג הזברה המבוגר. וכך, רפלקס optokinetic שימש למעקב שינויים תפקודיים בדגים שאינם מורדמים. זה היה בתוספת היסטולוגיה, כמו גם staini immunohistochemicalng לאפופטוזיס (TUNEL) וההתפשטות (PCNA) כדי לתאם שינויים מורפולוגיים פיתוח.
לסיכום, אפופטוזיס של קולטני אור מתרחש שלושה ימים לאחר טיפול MNU, אשר מלווה ירידה ניכרת של תאים בשכבה החיצונית הגרעינית (ONL). לאחר מכן, התפשטות של תאים בשכבת הגרעין הפנימי (INL) וONL הוא ציין. בזאת, אנו מגלים שלא רק היסטולוגית אך מלאים גם התחדשות תפקודית מתרחשת על פני מסלול של 30 ימים זמן. עכשיו אנחנו ממחישים את השיטות לכמת ומעקב דה דג הזברה רשתית והתחדשות באמצעות MNU בוידאו בפורמט.
Introduction
חזון הוא התחושה חיונית ביותר לאדם ויש לו ירידת הערך שלה השפעה חברתית וכלכלית גבוהה. בעולם המפותח, מחלות ניווניות ברשתית הן הסיבה המובילה לאיבוד ראייה ועיוורון בקרב אנשים מבוגרים 1. הסיבה למרבית המחלות רשתית ניווניות מובנת רק בחלקו ופתרונות טיפוליים כדי להחזיר את החזון אבוד הם מאוד מוגבלים. רטיניטיס פיגמנטוזה הוא דוגמא אופיינית למחלה ניוונית של רשתית עם אובדן קולטי אור העיקרי 2-3. N -methyl- -nitrosourea N (MNU) גורם לניוון רשתית ולכן בשימוש נרחב במכרסמים מודל מחלות עם מוות של תאי קולטי אור עיקריים 4. זה סוכן אלקילציה ומוביל לגידולים שפירים וממאירים, אשר מופיעים בדרך כלל מספר חודשים לאחר החשיפה 5-7. בנוסף, הוא גורם למוות של תאי קולטי אור ספציפיים בתוך תקופת תצפית לטווח קצר. וכך, אובדן structu שכבת הרשתיתמחדש ודילול רשתית משמעותי נצפה באופן תלוי ריכוז. תאי גליה רשתית הופעלו, אך לא חלה שינויים באפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) נמצאו. אפופטוזיס הקשורות במתח reticulum (ER) endoplasmic נראה המסלול העיקרי של פעולת MNU ברשתית 8.
יש לנו לאחרונה הצגתי MNU כמודל כימי כדי לגרום לניוון קולטי אור בדג הזברה 9. , בין שאר, דג הזברה (Danio rerio) הפכה להיות חשובה במחקר חזותי בגלל הדמיון של מערכת הראייה שלה לזה של בעלי חוליות אחרות 10. הרשתית החיצונית מכילה קולטני האור, שניתן לקבץ לארבעה סוגים שונים קונוס עם רגישויות שיא באולטרה הסגול, קצר, בינוני, ואורך גל של הספקטרום הנראה לעין ארוכה וסוג קולטי אור מוט אחד. בשכבת הגרעין הפנימית (INL), גופי התא של הפרעה דו קוטבית, וinterneurons אופקיים, amacrine נמצאים, כמו well כסומה התא של תאי גליה מולר. בשכבת plexiform החיצוני (OPL) הקשרים סינפטיים בין קולטני אור והרשתית הפנימית נוצרים, ואילו שכבת התא הקרובה ביותר לעדשה היא שכבת תא גנגליון (GC), שרכיבים יוצר אקסונים ארוכים המרכיבים את עצב הראייה ומערכת הראייה . קשרים סינפטיים בין תאי הגנגליון והתאים בשכבת הגרעין הפנימי נוצרים בשכבה הפנימית plexiform (IPL) 11. הרשתית נמצאת מחוץ לרשתית נוירו ומקיפה מגזרים חיצוניים קולטי האור עם microvilli הפסגה ארוך 12. יתר על כן, דג הזברה הוא משובי ומסוגלים להצמיח מחדש מוח פצוע, רשתית, חוט השדרה, לב ורקמות אחרות 13 מאוד. כאשר נזק לרשתית מתרחשת, תאים בINL, אשר נחשבו לתאי מולר, מופעלים ויש להם הפוטנציאל להתמיין לסוגי תאים ברשתית שונים. בנוסף, הם גם ליצור אבות מוט, אשר ממוקמים בONL. כך אחרurce שמספק את הרשתית של דג הזברה מבוגרת עם תאים חדשים הוא האזור השולי הריסים. יש צורך במקור זה כדי להשיג צפיפות קבועה של קולטני אור מוט בעין דג הזברה גדלה ברציפות 14.
מודל MNU יכול לשמש כגישת ניוון / התחדשות פשוטה לשחזור לרקמת רשתית. בשל דמיון מסוים של תהליכים ביולוגיים בדג זברה ובבני אדם זה יכול לפתוח את הדלתות כדי לזהות מסלולים מעורבים מוות של תאים ולהקרין תרופות נוירו פוטנציאליות. בהתבסס על מחקר קודם מהקבוצה שלנו, אנחנו עכשיו להמחיש את השיטות של מודל דג הזברה-Induced MNU זו של דה ברשתית והתחדשות כתוצאה מכך לרבות שינויים פונקציונליים עם פי מעבדה קטעי וידאו 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבר, הקבוצה שלנו העבירה את מודל MNU של ניוון קולטי אור ממכרסמים למערכת דג הזברה 9. האירועים שלאחר מכן תוארו ואחריו לתקופה של עד 30 ימים. בפרק זמן זה ניוון רשתית מלא מורפולוגיים והתחדשות התרחשו לאחר הטיפול הראשוני. ראשית, היסטולוגיה מגלה תא מוט מופחת לספור מיום 3 בע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Monika Kilchenmann, Federica Bisignani and Agathe Duda for their excellent technical assistance.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
| Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| TrizmaÒ base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).
- Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura, T., Usui, Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities. J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).
- Morton, D., et al. N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies. Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).
- Terracini, B., Testa, M. C. Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats. 24, 588-598 (1970).
- Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).
- Tappeiner, C., et al. Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU). PLOS One. 12, (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).
- Fleisch, C., Neuhauss, S. Visual Behavior in Zebrafish. Zebrafish. 3, 191-201 (2006).
- Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina. InterScience. 288, 653-662 (2006).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
- Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
- Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9 (1), 10 (2012).
- Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).
- Nelson, C. M., Hyde, D. R. Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish. J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).
- Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in. Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
