Метилнитрозомочевины (МНУ) -индуцированных дегенерации сетчатки и регенерации в данио рерио: гистологические и функциональные характеристики
Summary
Здесь мы показываем, количественное сетчатки де- и регенерации и ее влиянии на зрительные функции с использованием н-метил-N -nitrosourea в взрослых данио. Вслед за распространением во внутреннем ядерном слое снижения остроты зрения и снижение числа фоторецепторов. Полный морфологический и функциональный регенерации произошло через 30 дней после первоначального лечения.
Abstract
Дегенеративных заболеваний сетчатки, например пигментный ретинит, с результате счет повреждения фоторецепторов для большинства потери зрения в индустриальном мире. Животные модели ключевое значение для изучения таких заболеваний. В этой связи фоторецепторов конкретных токсин N-метил-N -nitrosourea (МНУ) широко используется в грызунов фармакологически индуцировать дегенерацию сетчатки. Ранее мы установили МНУ-индуцированной сетчатки модель дегенерации в данио, другой популярной моделью системы в визуальном исследовании.
Увлекательный разница млекопитающим является стойким нейрогенез во взрослом сетчатке рыбок данио и его регенерации после повреждения. Для количественной оценки этого наблюдения мы использовали измерения остроты зрения в взрослых данио. Таким образом, оптокинетическим рефлекс был использован, чтобы следовать функциональные изменения в не-анестезированных рыбы. Это была дополнена гистологии, а также иммуногистохимического stainiнг для апоптоза (TUNEL) и пролиферации (PCNA) соотнести развивающимся морфологические изменения.
Таким образом, апоптоз фоторецепторов происходит через три дня после обработки НММ, за которым следует заметному снижению клеток во внешнем ядерном слое (ОНЛ). После этого, пролиферация клеток во внутреннем ядерном слое (INL) и ONL наблюдается. В данном случае мы показали, что не только полное гистологическое, но и функциональный регенерации происходит в течение времени течение 30 дней. Теперь мы иллюстрируют способы количественно и следить за данио сетчатки де- и регенерации с помощью MNU в видео-формате.
Introduction
Видение является наиболее существенным смысл для человека и его обесценения имеет высокую социально-экономические последствия. В развитых странах мира, дегенеративных заболеваний сетчатки являются ведущей причиной потери зрения и слепоты среди пожилых людей 1. Причиной большинства дегенеративных заболеваний сетчатки лишь частично понял и лечебная решения, чтобы восстановить утраченное зрение очень ограничены. Пигментный ретинит является типичным примером сетчатки дегенеративных заболеваний с первичным потери фоторецепторов 2-3. N-метил-N -nitrosourea (MNU) индуцирует дегенерацию сетчатки и поэтому широко используется в грызунов моделировать заболевания со смертью первичного фоторецепторов клеток 4. Это алкилирующий агент и приводит к доброкачественных и злокачественных опухолей, которые обычно появляются через несколько месяцев после заражения 5-7. Кроме того, это приводит к смерти клетки фоторецептора конкретных пределах краткосрочного периода наблюдения. Таким образом, потеря сетчатки слоя structuповторно и значительное истончение сетчатки наблюдалось в зависимости от концентрации. Сетчатки глиальных клеток активировались, но никаких изменений в пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) не были найдены. Эндоплазматической сети (ER) связанные со стрессом апоптоз, кажется, основным каналом НММ действий в сетчатке 8.
Мы недавно ввели MNU как химической модели индуцировать дегенерацию фоторецепторов у рыбок данио 9. Среди других причин, данио (Danio rerio) стало важным в визуальном исследовании из-за сходства его зрительной системы в том, что из других позвоночных 10. Внешняя сетчатка содержит фоторецепторы, которые могут быть сгруппированы в четырех различных типов колбочек с пиковыми чувствительности в ультрафиолетовой, короткого, среднего и длительного длины волны видимого спектра и одной штанги типа фоторецепторов. Во внутреннем ядерном слое (INL), клеточных тел биполярных, горизонтальных и амакринных интернейронов встречаются, как вэйл как клетки сомы Мюллера глиальные клетки. Во внешнем слое плексиформной (ССО) синаптические контакты между фоторецепторов и внутренней сетчатки образуются, в то время как клетки слоя ближайший к линзе является слое ганглиозных клеток (ГХ), какие компоненты образуют длинные аксоны, содержащие зрительный нерв и зрительный тракт . Синаптических контактов между ганглиозных клеток и клеток во внутреннем ядерном слое образуются во внутреннем слое плексиформной (IPL) 11. НПП лежит вне нейросенсорной сетчатки и окружает наружных сегментов фоторецепторов с длинной апикальной микроворсинок 12. Кроме того, данио очень регенеративная и в состоянии вырастить поврежденного мозга, сетчатки, спинной мозг, сердце и другие ткани 13. При возникновении повреждения сетчатки, клетки в INL, которые, как считается, Мюллер клетки, активизируются и есть потенциал, чтобы дифференцироваться в различных типов клеток сетчатки. Кроме того, они также порождают стержневые клетки-предшественники, которые расположены в ONL. Другой такurce, которая поставляет на сетчатку взрослых данио с новых клеток является мерцательная маргинальной зоны. Этот источник необходим, чтобы обеспечить постоянную плотность стержневых фоторецепторов в постоянно растущей данио глаза 14.
Эта модель НММ можно использовать в качестве простого и воспроизводимым подход дегенерации / регенерации для ткани сетчатки. Благодаря их сходству биологических процессов у рыбок данио и у людей это может открыть двери для идентификации вовлеченных пути клеточной гибели и экранировать потенциальных ноотропных препаратов. Основываясь на предыдущем исследовании от нашей группы, мы сейчас иллюстрируют способы этого МНУ-индуцированной данио модели сетчатки де- и последующей регенерации включая функциональные изменения с соответствии лабораторный видео 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ранее наша группа передала мну модель дегенерации фоторецептора от грызунов в данио системы 9. Последующие события были описаны и последовал на срок до 30 дней. В этот период времени полный сетчатки морфологическая дегенерация и регенерация произошедших после первоначального ле?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Monika Kilchenmann, Federica Bisignani and Agathe Duda for their excellent technical assistance.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
| Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| TrizmaÒ base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).
- Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura, T., Usui, Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities. J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).
- Morton, D., et al. N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies. Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).
- Terracini, B., Testa, M. C. Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats. 24, 588-598 (1970).
- Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).
- Tappeiner, C., et al. Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU). PLOS One. 12, (2013).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).
- Fleisch, C., Neuhauss, S. Visual Behavior in Zebrafish. Zebrafish. 3, 191-201 (2006).
- Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina. InterScience. 288, 653-662 (2006).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
- Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
- Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9 (1), 10 (2012).
- Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).
- Nelson, C. M., Hyde, D. R. Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).
- Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish. J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).
- Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in. Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
