Hierin tonen we kwantificering van retinale de- en regeneratie en de impact ervan op de visuele functie met behulp van N-methyl-N -nitrosourea in de volwassen zebravissen. Verlies van gezichtsscherpte en verminderde fotoreceptor nummers volgde proliferatie in de binnenste kernlaag. Compleet morfologische en functionele regeneratie trad 30 dagen na de eerste behandeling.
Retinale degeneratieve ziekten, zoals retinitis pigmentosa, met de daaruit voortvloeiende schade fotoreceptor maken het merendeel van gezichtsverlies bij de industriële wereld. Diermodellen zijn van cruciaal belang om deze ziekten te bestuderen. In dit verband de fotoreceptor-specifieke toxine N-methyl-N -nitrosourea (MNU) is op grote schaal gebruikt in de knaagdieren om farmacologisch induceren retinale degeneratie. Eerder hebben we een MNU geïnduceerde retinale degeneratie model in de zebravis, een andere populaire modelsysteem visueel onderzoek vastgesteld.
Een fascinerende verschil met zoogdieren is de aanhoudende neurogenese in de volwassen zebravissen netvlies en de regeneratie na beschadiging. Om deze waarneming hebben wij gezichtsscherpte metingen die werkzaam zijn in de volwassen zebravissen kwantificeren. Daardoor werd de optokinetische reflex gebruikte functionele mutaties in niet-verdoofde vis volgen. Dit werd aangevuld met histologie en immunohistochemie staining apoptose (TUNEL) en proliferatie (PCNA) de ontwikkeling morfologische veranderingen correleren.
Samengevat, apoptose van fotoreceptoren treedt drie dagen na MNU behandeling, gevolgd door een duidelijke vermindering van cellen in de buitenste nucleaire laag (ONL). Daarna wordt proliferatie van cellen in de binnenste nucleaire laag (INL) en ONL waargenomen. Hierin tonen we dat niet alleen een volledige histologisch maar ook een functionele regeneratie plaatsvindt gedurende een tijdsverloop van 30 dagen. Nu illustreren we de methoden te kwantificeren en op te volgen zebravis netvlies de- en regeneratie met behulp van MNU in een video-formaat.
Visie is de meest essentiële zin voor de mens en zijn bijzondere waardevermindering heeft een hoge sociaal-economische impact. In de ontwikkelde wereld, retinale degeneratieve ziekten zijn de belangrijkste oorzaak van gezichtsverlies en blindheid bij oudere volwassenen 1. De oorzaak van de meeste degeneratieve retinale ziekten is nog niet duidelijk en therapeutische oplossingen voor verloren gezichtsvermogen herwinnen zeer beperkt. Retinitis pigmentosa is een typisch voorbeeld van een retinale degeneratieve ziekte primaire fotoreceptor verlies 2-3. N-methyl-N -nitrosourea (MNU) induceert retinale degeneratie en wordt daarom veel gebruikt in knaagdieren model ziekten met primaire fotoreceptorcellen celdood 4. Het is een alkylerend middel en leidt tot goedaardige en kwaadaardige tumoren, die meestal verschijnen enkele maanden na blootstelling 5-7. Bovendien veroorzaakt het specifieke lichtgevoelige celdood in een korte observatieperiode. Daarbij, het verlies van de retinale laag structure en significant retinale dunner werden waargenomen bij een concentratie-afhankelijke wijze. Retinale glia cellen geactiveerd, maar geen veranderingen in het retinale pigmentepitheel (RPE) gevonden. Endoplasmatisch reticulum (ER) stressgerelateerde apoptose lijkt de belangrijkste route van MNU actie in de retina 8.
We hebben onlangs MNU als een chemisch model naar fotoreceptor degeneratie veroorzaken in de zebravis 9. Onder andere redenen, heeft de zebravis (Danio rerio) belangrijk visueel onderzoek worden als gevolg van de gelijkenissen van zijn visuele systeem met dat van andere gewervelde dieren 10. De buitenste retina bevat fotoreceptoren, die kan bestaan uit vier verschillende types conus met gevoeligheidspieken in het ultraviolet, korte, middellange en lange golflengte van het zichtbare spectrum en een staaf fotoreceptor type. In de binnenste nucleaire laag (INL), worden de cellichamen bipolaire horizontale en amacriene interneuronen vond, als well als de cel soma van Muller gliacellen. In de buitenste plexiform laag (OPL) de synaptische contacten tussen fotoreceptoren en de binnenste netvlies worden gevormd, terwijl de cellaag die het dichtst bij de lens van het ganglion cellaag (GC), welke onderdelen lange axonen, bestaande uit de oogzenuw en het optische-darmkanaal te vormen is . Synaptische contacten tussen de ganglioncellen en de cellen in de binnenste nucleaire laag worden gevormd in het binnenste plexiform laag (IPL) 11. De RPE ligt buiten het neurosensorische netvlies en omringt de fotoreceptor buitenste segmenten met lange apicale microvilli 12. Bovendien is de zebravis zeer regeneratieve en kunnen laesie hersenen, retina, ruggenmerg, hart en andere weefsels 13 teruggroeien. Bij retinale schade ontstaat, cellen in de INL, die vermoedelijk Müller cellen, worden geactiveerd en hebben het potentieel om te differentiëren in verschillende retinale celtypen. Bovendien genereren ze staaf progenitors, die zich in de ONL. Ander zource dat het netvlies van volwassen zebravissen voorziet van nieuwe cellen is de ciliaire marginale zone. Deze bron is nodig om een constante dichtheid van de stang fotoreceptoren bereiken de steeds groeiende zebravisoog 14.
De MNU model kan worden gebruikt als een eenvoudige en reproduceerbare degeneratie / regeneratie benadering voor retinale weefsel. Als gevolg van bepaalde overeenkomsten van biologische processen in de zebravis en de mens deze de deuren kon openen om mee celdood paden te identificeren en mogelijke neuroprotectieve drugs screenen. Gebaseerd op een eerdere studie van onze groep, we nu illustreren de werkwijzen van deze MNU geïnduceerde zebravis model van retinale de- en daaropvolgende regeneratie waaronder functionele verandering ten volgens labo's 9.
Eerder heeft onze groep de MNU model van fotoreceptor degeneratie overgedragen van knaagdieren in de zebravis systeem 9. De daaropvolgende gebeurtenissen werden beschreven en gevolgd gedurende maximaal 30 dagen. In deze periode volledige retinale degeneratie en morfologische regeneratie trad na de eerste behandeling. Eerst histologie onthult een verminderde staaf celgetal vanaf dag 3 op met een minimum op dag 8 Dienovereenkomstig TUNEL kleuring identificeert apoptose van stang fotoreceptoren 3 dagen na MNU be…
The authors have nothing to disclose.
We thank Monika Kilchenmann, Federica Bisignani and Agathe Duda for their excellent technical assistance.
Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
TrizmaÒ base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |