Methylnitrosoharnstoff (MNU) induzierten Netzhautdegeneration und Regeneration im Zebrafisch: Die histologische und funktionelle Eigenschaften

Summary

Hier zeigen wir Quantifizierung der Netzhaut De- und Regeneration und ihre Auswirkungen auf die visuelle Funktion mit N-Methyl-N -nitrosourea im erwachsenen Zebrafisch. Verlust der Sehschärfe und verminderte Photorezeptorzahlen wurden durch Proliferation in der inneren Kernschicht gefolgt. Vollständige morphologische und funktionelle Regeneration aufgetreten 30 Tage nach der ersten Behandlung.

Abstract

Degenerativer Netzhauterkrankungen, beispielsweise Retinitis pigmentosa, mit daraus resultierenden Schäden Konto Photorezeptor für die Mehrheit der Verlust der Sehkraft in der industriellen Welt. Tiermodelle sind von zentraler Bedeutung, um solche Krankheiten zu studieren. In diesem Zusammenhang wird der Photorezeptor-spezifischen N-Methyl-N-Toxin -nitrosourea (MNU) ist weit verbreitet in Nagetieren verwendet, um pharmakologisch herbeiNetzHautDegeneration. Bisher haben wir eine MNU-induzierte Degeneration der Netzhaut-Modell in der Zebrafisch, ein weiteres beliebtes Modellsystem in der visuellen Forschung etabliert.

Eine faszinierende Unterschied zu den Säugetieren ist die anhaltende Neurogenese im erwachsenen Zebrafisch Netzhaut und ihre Regeneration nach der Beschädigung. Um diese Beobachtung haben wir Sehschärfe Messungen im erwachsenen Zebrafisch eingesetzt quantifizieren. Dabei wurde die optokinetischen Reflex verwendet, um funktionelle Veränderungen in nicht-narkotisierten Fische folgen. Dies wurde mit der Histologie sowie immunhistochemischen staini ergänztng für die Apoptose (TUNEL) und Proliferation (PCNA), die Entwicklungs morphologischen Veränderungen zu korrelieren.

Zusammenfassend, die Apoptose von Photorezeptoren erfolgt drei Tage nach MNU Behandlung, die durch eine deutliche Verringerung der Zellen in der äußeren Körnerschicht (ONL) folgt. Danach wird die Proliferation von Zellen in der inneren Kernschicht (INL) und ONL beobachtet. Hier offenbaren wir, dass nicht nur eine vollständige histologische sondern auch eine funktionelle Regeneration über einen Zeitraum von 30 Tagen auf. Jetzt zu veranschaulichen wir die Methoden zur Quantifizierung und Follow-up Zebrafisch Netzhaut De- und Regeneration mit MNU in einem Video-Format.

Introduction

Vision ist der wichtigste Sinn für den Menschen und seine Wertminderung hat einen hohen sozioökonomischen Auswirkungen. In der entwickelten Welt sind degenerativer Netzhauterkrankungen die häufigste Ursache für Sehverlust und Erblindung bei älteren Erwachsenen ^1. Die Ursache der meisten degenerativen Netzhauterkrankungen ist nur teilweise verstanden und therapeutische Lösungen, um verlorene Vision wieder sehr eingeschränkt. Retinitis pigmentosa ist ein typisches Beispiel einer degenerativen Netzhauterkrankungen mit primären Photorezeptorverlust ^2-3. N-Methyl-N -nitrosourea (MNU) induziert Degeneration der Netzhaut und ist deshalb weit verbreitet in Nagetieren verwendet, um Krankheiten mit primären Photorezeptorzelle Tod ^4-Modell. Es ist ein Alkylierungsmittel und führt zu gutartigen und bösartigen Tumoren, die in der Regel werden mehrere Monate nach der Belichtung ^5-7. Darüber hinaus werden spezifische Photorezeptor Zelltod bewirkt, dass es innerhalb eines kurzen Zeitbeobachtungszeitraum. Dadurch wird der Verlust an retinalen Schicht structure und der wesentlichen Netzhautverdünnung wurden in einer konzentrationsabhängigen Weise beobachtet. Netzhaut-Gliazellen aktiviert wurden, aber keine Änderungen im retinalen Pigmentepithel (RPE) wurden gefunden. Endoplasmatischen Retikulum (ER) Stress-Apoptose scheint der Hauptweg von MNU Aktion in der Netzhaut ⁸ sein.

Wir haben vor kurzem MNU als chemisches Modell Photorezeptordegeneration im Zebrafisch ⁹ induzieren. Neben anderen Gründen ist der Zebrafisch (Danio rerio) ist wegen der Ähnlichkeiten der visuellen System zu anderen Wirbeltieren ¹⁰ in der visuellen Forschung wichtig. Die äußere Netzhaut enthält den Photorezeptoren, die in vier verschiedenen Zapfentypen mit Spitzenempfindlichkeiten in den ultravioletten, kurze, mittlere und lange Wellenlängen des sichtbaren Spektrums und eine Stange Photorezeptor-Typ gruppiert werden können. In der inneren Körnerschicht (INL) werden die Zellkörper der bipolaren, horizontalen und amacrine Inter gefunden, als well als Zellsoma Müller Gliazellen. In der äußeren plexiformen Schicht (OPL) die synaptischen Kontakte zwischen Photorezeptoren und der inneren Netzhaut gebildet werden, wohingegen die Zellschicht am nächsten an der Linse ist die Ganglienzellschicht (GC), die Bestandteile lange Axone, die den Sehnerv und die Sehbahn bilden . Synaptischen Kontakte zwischen Ganglienzellen und die Zellen in der inneren Kernschicht in der inneren plexiformen Schicht (IPL) ¹¹ ausgebildet sind. Die RPE liegt außerhalb der neurosensorischen Netzhaut und umgibt die Photorezeptoraußensegmente mit langen apikalen Mikrovilli ^12. Weiterhin ist die Zebrafisch hoch regenerativen und Verletzungen ist in der Lage, Gehirn, Retina, Rückenmark, Herz und anderen Geweben ¹³ nachwachsen. Wenn Netzhautschädigung auftritt, Zellen in der INL, die vermutlich Müller Zellen werden aktiviert und das Potential haben, in verschiedenen Netzhautzelltypen zu differenzieren. Darüber hinaus erzeugen sie auch Stange Vorläufern, die in der ONL befinden. Ein weiteres source, die die Netzhaut des erwachsenen Zebrafisch mit neuen Zellen liefert die ciliary Randzone. Diese Quelle ist erforderlich, um eine konstante Dichte der Stäbchen-Photorezeptoren in den kontinuierlich wachsenden Zebrafischauge ¹⁴ zu erzielen.

Die MNU-Modell kann als eine einfache und reproduzierbare Degeneration / Regeneration Ansatz für Netzhautgewebe eingesetzt werden. Aufgrund bestimmter Ähnlichkeiten der biologischen Prozesse im Zebrafisch und in den Menschen könnte dies die Türen zu öffnen, sich zu engagieren Zelltod Wege zu identifizieren und mögliche neuroprotektive Medikamente auszusortieren. Basierend auf einer früheren Studie aus unserer Gruppe, jetzt haben wir veranschaulichen die Methoden dieser MNU-induzierte Zebrafisch-Modell der Netzhaut De- und konsequente Regeneration einschließlich funktionelle Veränderungen mit nach Labor Videos ^9.

Protocol

Alle Versuche der Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen und Vision Research von der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) eingehalten werden. 1. Tiere Pflegen Sie die Wildtyp-Zebrafisch (Danio rerio) der AB (Oregon) Spannung zwischen 6-12 Monaten unter Standardbedingungen in Wasser mit einer Temperatur von 26,5 ° C und einem 14/10 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus 15 Jahren. Befolgen Sie die Tierpflege-Richtlinien d…

Representative Results

Sehschärfe: Der Versuchsaufbau [Ortsfrequenz: 0,042 Kreise / Grad (C / D); Kontrast: 100%; Driftgeschwindigkeit: 20 Grad / Sekunde (d / src); Hintergrundbeleuchtung Helligkeit: 152 cd / m 2] der Studie aktiviert OKR Beurteilung der erwachsenen Zebrafisch. Die mittlere Dauer der VA Messung war etwa 5 – 10 Minuten für jeden Zebrafisch, die das Verfahren gut vertragen. Sehschärfe vor MNU Exposition war 0,577 ± 0,014 Zyklen / Grad (c / d). Abbildung 1 zeigt den Ve…

Discussion

Bisher hat unsere Gruppe die MNU Modell der Photorezeptordegeneration von Nagetieren in den Zebrafisch-System ⁹ übertragen. Die folgenden Ereignisse wurden beschrieben und anschließend für bis zu 30 Tage. In dieser Zeit trat vollständige Netzhaut morphologischen Degeneration und Regeneration nach der ersten Behandlung. Erstens zeigt die Histologie eine reduzierte Stange Zellzahl von Tag 3 auf mit einem Minimum an Tag 8. Entsprechend identifiziert TUNEL-Färbung Apoptose von Stäbchen-Photorezeptoren 3 Tag…

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A6283
Ammonia	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	294993	0.80%
Bovine serum albumine (BSA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	05470
Dako Pen	Dako, Glostrup, Danmark	S2002
DAPI mounting medium	Vector Labs, Burlingame, CA, USA	H-1200
Eosin	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	45260
Ethanol	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2860	100%, 96%, 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	ED
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	E10521	Tricaine
Eukitt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	3989
Goat anti-rabbit Alexa 594	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11012
Goat normal serum	Dako, Glostrup, Danmark	X0907
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	320331	0.20%
In situ Cell Death Detection Kit	Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland	11684795910	TUNEL Kit
Mayer's hemalum solution	Merck, Darmstadt, Germany	109249
Methylnitrosourea (MNU)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	N4766	Toxic
OptoMotry	CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada	n.a.
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Proteinase K	Dako, Glostrup, Danmark	S3004
Rabbit anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA	sc-33756
Superfrost Plus glass slides	Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany	10149870
Tris buffered saline (TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5912
TrizmaÒ base	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	T1503
Tween 20	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P1379
Xylene	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	534056
Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain	University of Fribourg, Dept. of Biology	n.a.	Own fish facility