التصوير الكالسيوم داخل الخلايا²⁺ إشارات في الجسم المخطط النجمية من الفئران الكبار باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا

Summary

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca²⁺ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca²⁺ signals within striatal astrocytes in situ.

Abstract

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca²⁺ concentration fluctuations ([Ca²⁺]_i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca²⁺]_i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca²⁺]_i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca²⁺]_i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca²⁺]_i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca²⁺]_i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca²⁺]_i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca²⁺]_i signals in the striatal microcircuitry.

Introduction

الخلايا النجمية هي الخلايا الدبقية في كل مكان وفيرة من الدماغ. ومن الثابت أن الخلايا النجمية خدمة الدعم الحيوي والأدوار التماثل الساكن بما في ذلك التخفيف من K ⁺ التركيز في الفضاء خارج الخلية، امتصاص الناقلات العصبية، فضلا عن توفير المواد المغذية. ومع ذلك، تشير الدراسات الحديثة أنها أيضا عرض [كا ^2+] _ط إشارات، والتي تحدث بشكل عفوي وبنسبة نشاط الخلايا العصبية ^1. وجود نجمية [كا ^2+] _ط إشارات لقد كان يعتقد على نحو متزايد لتحريك تواصلهم مع الخلايا العصبية، وعلى هذا النحو قد تفسر على أنها شكل من أشكال "كا ²⁺ استثارة" داخل الخلايا النجمية. وتشير البيانات المتاحة على مدى العقدين الماضيين في ضبط الخلايا النجمية والخلايا العصبية التي قد تواصل، ربما بطريقة ثنائية الاتجاه. أولا، تستجيب الخلايا النجمية في كثير من الأحيان مع زيادة في [كا ^2+] _أنا عندما تفعيلها من خلال الموصلات العصبية وneuromodulators سراحهم من الخلايا العصبية ^2. الثانية، [كا ^2+] _ط زيادات في الخلايا النجمية تسبب اطلاق سراح يشير الجزيئات من الخلايا النجمية التي بدورها قد تؤثر على الخلايا العصبية والأوعية الدموية. تشير الدلائل إلى أن الجزيئات التي صدرت من الخلايا النجمية تؤدي إلى تغيرات في وظائف من نقاط الاشتباك العصبي، والدوائر والسلوك في نهاية المطاف ^3-5 عبر نجمية إلى إشارات الخلايا العصبية. ومع ذلك، يظل هذا المجال البحوث تتطور بسرعة، وقيل أن فهم أفضل ومفصل نجمية [كا ^2+] هناك حاجة _ط لحل بعض الشكوك الحالية ^6.

في الأعمال السابقة، وقد تبين أن تحميل الجزء الأكبر من العضوية الكالسيوم ²⁺ الأصباغ مؤشر إلى فشل الخلايا النجمية لكشف موثوق [كا ^2+] _ط إشارات داخل الخلايا النجمية بكاملها في الثقافة ^و7-10 في الموقع. وقد نوقشت هذه النتائج من قبل الولايات المتحدة وغيرها ^6،11،12. ومؤسسة Emerginز الصورة هي أن [كا ^2+] _ط إشارات ضمن عمليات نجمية (على سبيل المثال، الفروع والأفرع)، وهي المواقع الأساسية للتفاعل مع الخلايا العصبية والأوعية الدموية، ونادرا ما يتم استكشافها بالتفصيل. في الآونة الأخيرة، واستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) مثل GCaMP3 عصاري خلوي، GCaMP5G وGCaMP6 وغشاء البلازما الإصدارات المربوطة (على سبيل المثال، LCK-GCaMP3) قد يسمح دراسة [كا ^2+] _ط إشارات في مقصورات صغيرة من الخلايا النجمية مثل هذه عمليات رقيقة، بالقرب من غشاء البلازما وداخل الأراضي كلها ^7،8. ومع ذلك، GECIs ديك عيب واحد على العضوية الكالسيوم ²⁺ مؤشر الأصباغ وهذا هو الشرط للطرق الوراثية لتقديم جينات ترميز بشكل انتقائي على الخلايا النجمية في الجسم الحي لفترات تتراوح بين أسابيع لGECIs أن يكون مناسب التعبير عنها. وعادة ما يتحقق التعبير في الجسم الحي باستخدام الفئران المعدلة وراثيا، الضربة القاضية في الفئران أو مع فيروس أساس تسليم التطبيقالصراصير. في المقالة إن الرب الحالية نفيدكم الأساليب والإجراءات المستخدمة لتقديم GECIs إلى الخلايا النجمية الجسم المخطط باستخدام فيروسات الغدة المرتبطة. ونحن نركز على خلوي GCaMP3 كمثال على ذلك، ولكن يعمل نفس الإجراء الأساسي لأي GECI الآخرين أو البروتين الفلوري مراسلة مقرها.

Protocol

وكانت جميع البروتوكولات الحيوانية وفقا للمعاهد الوطنية الأمريكية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة كاليفورنيا. 1.1) إعداد ممص مكروى وAAV2 / 5 الفيروسات ت…

Representative Results

للتعبير محدد نجمية من خلوي GCaMP3 في المخطط، استخدمنا الغدة المرتبطة الفيروسات (AAV) من 5 المصلي، وGFAP GfaABC 1 D المروج (الشكل 1A)، وهو ما ثبت سابقا أن يقود GCaMP3 قوية ومراسل الجين التعبير في قرن آمون والقشرية الخلايا النجمية 8،14. بعد أسبوعين من حقن مكروي الفير…

Discussion

وقد أتاحت الطرق الموصوفة هنا لنا للتعبير عن خلوي GCaMP3 الخلايا النجمية في الجسم المخطط في الجسم الحي لاحق [كا ^2+] _ط التصوير في الموقع. هذا الأسلوب له مزايا أكثر باستخدام الفئران المعدلة وراثيا أو الضربة القاضية في، بما في ذلك التعبير القوي للاستهدا?…

Materials

Syringe Pump	Harvard Apparatus	704506
Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Narishige	PC-10
Micropipette grinder	Narishige	EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3	Addgene	44331	a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
I mL syringe	BD	309628
syringe needle	BD	305109
AAV2/5 virus	UPenn vector core	NA
Sudan red IV	Sigma-Aldrich	67386
Mineral oil	CVS Pharmacy	152355
Cryostat	Leica	CM3050 S
Stereotaxic instrument	David Kopf Instruments	900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit	FOREDOM	K.1070
Paraformaldehyde	Santa cruz biotechnology	sc-281692
Super Glue	Krazy®Glue	KG925
Microslicer	Ted Pella	DTK-Zero 1
Confocal microscopes	Olympus	FV300 and FV1000
Normal goat serum	Vector	S-1000
chicken anti-GFP	Abcam	ab13970
mouse anti-s100β	Sigma-Aldrich	S2532
mouse anti-NeuN	Millipore	MAB377
mouse anti-glutamine synthetase	Millipore	MAB302
goat anti-mouse-Alexa546	Invitrogen	A11003
goat anti-chicken-Alexa488	Invitrogen	A11039
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5J
Mounting Medium	Vector	H-1000