Imagens intracelular Ca²⁺ Sinais em estriado astrócitos de ratos adultos, através de indicadores de cálcio geneticamente codificados

Summary

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca²⁺ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca²⁺ signals within striatal astrocytes in situ.

Abstract

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca²⁺ concentration fluctuations ([Ca²⁺]_i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca²⁺]_i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca²⁺]_i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca²⁺]_i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca²⁺]_i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca²⁺]_i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca²⁺]_i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca²⁺]_i signals in the striatal microcircuitry.

Introduction

Os astrócitos são células gliais ubíquas e abundantes do cérebro. Está bem estabelecido que os astrócitos servir de suporte vital e papéis homeostáticos incluindo buffer de K ⁺ concentração no espaço extracelular, a captação de neurotransmissores, bem como o fornecimento de nutrientes. No entanto, estudos recentes mostram que eles também exibem [Ca ^2+] _i sinais, que ocorrem espontaneamente e são aumentados pela atividade neuronal ^1. A existência de astrócitos [Ca ^2+] _i sinalização tem sido cada vez mais pensado para provocar a sua comunicação com os neurônios, e, como tal, tem sido interpretada como uma forma de "Ca ²⁺ excitabilidade" dentro de astrócitos. Os dados disponíveis sobre as últimas duas décadas sugerem duas configurações em que os astrócitos e neurônios podem se comunicar, talvez, de forma bidirecional. Em primeiro lugar, os astrócitos, muitas vezes respondem com um aumento na [Ca ^2+] _i, quando activado pelos neurotransmissores eneuromoduladores liberados de neurônios ^2. Em segundo lugar, [Ca ^2+] _i aumenta em astrócitos causam a liberação de moléculas de sinalização de astrócitos, que por sua vez podem afetar os neurônios e vasos sanguíneos. As evidências sugerem que as moléculas liberadas a partir de astrócitos levar a alterações nas funções de sinapses, circuitos e, em última instância comportamento ^3-5 via de sinalização astrócitos-a-neurônio. No entanto, esta continua a ser uma área de pesquisa em rápido desenvolvimento, e tem-se argumentado que uma compreensão melhor e detalhada de astrócitos [Ca ^2+] _i é necessário para resolver algumas das incertezas atuais ^6.

Em trabalhos anteriores, foi demonstrado que o carregamento em massa de orgânicos Ca ²⁺ corantes indicador em astrócitos não consegue detectar com fiabilidade [Ca ^2+] _i sinais dentro astrócitos inteiras em cultura e in situ ^10/07. Estes resultados foram discutidos por nós e outros ^6,11,12. A Emerging imagem é que [Ca ^2+] _i sinais dentro dos processos de astrócitos (por exemplo, ramos e raminhos), que são os principais sítios de interação com neurônios e vasos sanguíneos, raramente têm sido explorados em detalhe. Recentemente, a utilização de indicadores de cálcio geneticamente codificados (Gecis), tais como GCaMP3 citosólica, GCaMP5G e GCaMP6 e membrana de plasma (por exemplo, versões tethered, Lck-GCaMP3) permitiu o estudo da [Ca ^2+] _i sinais em pequenos compartimentos de astrócitos tais processos como finas, perto da membrana do plasma e dentro territórios inteiros ^7,8. No entanto, Gecis têm uma desvantagem sobre orgânicos Ca ²⁺ corantes indicadores e que é a exigência de métodos genéticos para entregar os genes que codificam para selectivamente astrócitos in vivo por períodos de semanas para a Gecis a ser apropriadamente expressa. Expressão in vivo é tipicamente alcançado utilizando camundongos transgênicos, bater-nos ratos ou com app entrega vírus baseadosbaratas. No presente artigo, relatamos JoVE métodos e procedimentos empregados para entregar Gecis para astrócitos do estriado usando vírus adeno-associados. Nós concentrar em cito-GCaMP3 como um exemplo, mas o mesmo procedimento básico funciona para qualquer outro GECI ou fluorescente repórter base de proteína.

Protocol

Todos os protocolos de animais estavam de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional na UCLA. 1.1) Prepare Micropipeta e AAV2 / 5 Vírus Carregando Use micropipetas de vidro de borosilicato finas para a injecção do vírus. Puxe a micropipeta usando um programa puxando de duas etapas com um puxador vertical. Bisel da pipeta com um ângulo de 40 °, utili…

Representative Results

Para a expressão especifica de astrócitos de cito-GCaMP3 no striatum, utilizou-se vírus adeno-associado (AAV), do serotipo 5, e a PGFA GfaABC 1 D promotor (Figura 1A), que tem sido mostrado previamente para dirigir GCaMP3 robusta e o gene repórter expressão no hipocampo e astrócitos corticais 8,14. Duas semanas após a micro-injecção de vírus para o corpo estriado do rato, o rato (~ 10 semanas de idade) foi perfundido e IHC foi realizada em secções de cérebro finas para…

Discussion

Os métodos aqui descritos nos permitiram expressar cito-GCaMP3 em astrócitos do estriado in vivo para posterior [Ca ^2+] _i imaging in situ. Este método apresenta vantagens em relação ao uso transgénica ou knock-em ratinhos, incluindo expressão robusta da proteína, rapidez e flexibilidade orientada de aplicação experimental e especificidade anatómica. A expressão de GCaMP3 usando AAV2 / 5, foi encontrada para ser mais específico e robusto. A combinação de GFAP GfaABC …

Materials

Syringe Pump	Harvard Apparatus	704506
Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Narishige	PC-10
Micropipette grinder	Narishige	EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3	Addgene	44331	a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
I mL syringe	BD	309628
syringe needle	BD	305109
AAV2/5 virus	UPenn vector core	NA
Sudan red IV	Sigma-Aldrich	67386
Mineral oil	CVS Pharmacy	152355
Cryostat	Leica	CM3050 S
Stereotaxic instrument	David Kopf Instruments	900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit	FOREDOM	K.1070
Paraformaldehyde	Santa cruz biotechnology	sc-281692
Super Glue	Krazy®Glue	KG925
Microslicer	Ted Pella	DTK-Zero 1
Confocal microscopes	Olympus	FV300 and FV1000
Normal goat serum	Vector	S-1000
chicken anti-GFP	Abcam	ab13970
mouse anti-s100β	Sigma-Aldrich	S2532
mouse anti-NeuN	Millipore	MAB377
mouse anti-glutamine synthetase	Millipore	MAB302
goat anti-mouse-Alexa546	Invitrogen	A11003
goat anti-chicken-Alexa488	Invitrogen	A11039
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5J
Mounting Medium	Vector	H-1000