Imagerie intracellulaire de Ca²⁺ Signaux dans Striatale astrocytes de souris adultes utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés

Summary

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca²⁺ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca²⁺ signals within striatal astrocytes in situ.

Abstract

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca²⁺ concentration fluctuations ([Ca²⁺]_i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca²⁺]_i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca²⁺]_i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca²⁺]_i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca²⁺]_i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca²⁺]_i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca²⁺]_i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca²⁺]_i signals in the striatal microcircuitry.

Introduction

Les astrocytes sont des cellules gliales omniprésents et abondantes du cerveau. Il est bien établi que les astrocytes servent soutien vital et rôles homéostatiques y compris tampon de concentration de K ⁺ dans l'espace extracellulaire, recaptage des neurotransmetteurs, ainsi que fournir des éléments nutritifs. Cependant, des études récentes montrent qu'ils affichent aussi [Ca2 ^+] _i signaux, qui se produisent spontanément et sont augmentés de l'activité neuronale ^1. L'existence d'astrocytes [Ca ^2+] _i la _{signalisation} a été de plus en plus pensé à déclencher leur communication avec les neurones, et en tant que tel a été interprétée comme une forme de "Ca ²⁺ excitabilité" dans les astrocytes. Les données disponibles au cours des deux dernières décennies suggèrent deux contextes dans lesquels les astrocytes et les neurones peuvent communiquer, peut-être d'une manière bidirectionnelle. Tout d'abord, les astrocytes réagissent souvent avec une augmentation de la [Ca ^2+] _i lorsqu'il est activé par les neurotransmetteurs etneuromodulateurs libérés par les neurones ^2. Deuxièmement, [Ca ^2+] _i augmente dans les astrocytes provoquer la libération de molécules de signalisation des astrocytes qui peuvent à leur tour affecter les neurones et les vaisseaux sanguins. Les preuves suggèrent que les molécules libérées par les astrocytes conduisent à des changements dans les fonctions de synapses, les circuits et en fin de compte le comportement de signalisation par l'intermédiaire de ^{3 à 5} astrocyte-à-neurone. Cependant, cela reste un domaine de recherche en plein développement, et il a été avancé que d'une meilleure compréhension et détaillée des astrocytes [Ca ^2+] _i est nécessaire pour résoudre certaines des incertitudes actuelles ^6.

Dans le travail passé, il a été démontré que le chargement en vrac de Ca ²⁺ organiques colorants indicateurs dans les astrocytes ne parvient pas à détecter de manière fiable [Ca ^2+] _i signaux dans les astrocytes entiers de la culture et in situ ^7-10. Ces résultats ont été discutés par nous et d'autres ^6,11,12. Le Emerging image est que [Ca ^2+] _i signaux au sein des processus d'astrocytes (par exemple, les branches et rameaux), qui sont les premiers sites d'interactions avec les neurones et les vaisseaux sanguins, ont rarement été étudiée en détail. Récemment, l'utilisation d'indicateurs de calcium génétiquement codées (GeCIS) comme GCaMP3 cytosolique, GCaMP5G et GCaMP6 et membrane plasmique versions captif (par exemple, Lck-GCaMP3) a permis l'étude de [Ca ^2+] _i signaux dans de petits compartiments de astrocytes ces processus minces, près de la membrane plasmique et dans des territoires entiers ^7,8. Cependant, GeCIS ont un inconvénient plus organiques Ca ²⁺ colorants indicateurs et qui est l'exigence des méthodes génétiques pour livrer les gènes codant sélective pour les astrocytes in vivo pour des périodes de plusieurs semaines pour la GeCIS être appropriée exprimé. Expression in vivo est généralement réalisé en utilisant des souris transgéniques, souris knock-in ou par le virus basé livraison appcafards. Dans l'article présent JoVE nous présentons les méthodes et procédures utilisées pour fournir GeCIS à astrocytes striataux utilisant des virus adéno-associés. Nous nous concentrons sur cyto-GCaMP3 comme un exemple, mais la même procédure de base fonctionne pour tout autre GECI ou fluorescent reporter à base de protéines.

Protocol

Tous les protocoles d'animaux étaient en conformité avec les Instituts nationaux américains de la santé Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'UCLA. 1.1) Préparer Micropipette et AAV2 / 5 Virus de chargement Utilisation de fines micropipettes en verre borosilicaté pour l'injection du virus. Tirez la micropipette en utilisant un programm…

Representative Results

Pour les astrocytes expression spécifique de cyto-GCaMP3 dans le striatum, nous avons utilisé un virus adéno-associé (AAV) du 5 serotype, et la GFAP GfaABC 1 promoteur de D (figure 1A), qui a été précédemment montré pour conduire GCaMP3 robuste et gène rapporteur expression dans l'hippocampe et les astrocytes corticaux 8,14. Deux semaines après le virus de la micro-injection dans le striatum de souris, la souris (~ 10 semaines) a été perfusée et IHC a été réali…

Discussion

Les méthodes décrites ici nous ont permis d'exprimer cyto-GCaMP3 dans les astrocytes du striatum in vivo pour la suite [Ca ^2+] _i imagerie in situ. Cette méthode a des avantages sur l'aide transgénique ou souris knock-in, y compris l'expression robuste de la protéine ciblée, la rapidité et la souplesse de mise en œuvre expérimentale et la spécificité anatomique. L'expression de GCaMP3 utilisant VAA2 / 5 a été trouvé pour être plus précis et robuste. …

Materials

Syringe Pump	Harvard Apparatus	704506
Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Narishige	PC-10
Micropipette grinder	Narishige	EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3	Addgene	44331	a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
I mL syringe	BD	309628
syringe needle	BD	305109
AAV2/5 virus	UPenn vector core	NA
Sudan red IV	Sigma-Aldrich	67386
Mineral oil	CVS Pharmacy	152355
Cryostat	Leica	CM3050 S
Stereotaxic instrument	David Kopf Instruments	900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit	FOREDOM	K.1070
Paraformaldehyde	Santa cruz biotechnology	sc-281692
Super Glue	Krazy®Glue	KG925
Microslicer	Ted Pella	DTK-Zero 1
Confocal microscopes	Olympus	FV300 and FV1000
Normal goat serum	Vector	S-1000
chicken anti-GFP	Abcam	ab13970
mouse anti-s100β	Sigma-Aldrich	S2532
mouse anti-NeuN	Millipore	MAB377
mouse anti-glutamine synthetase	Millipore	MAB302
goat anti-mouse-Alexa546	Invitrogen	A11003
goat anti-chicken-Alexa488	Invitrogen	A11039
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5J
Mounting Medium	Vector	H-1000