Abbildungsintrazellulären Ca²⁺ Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

Summary

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca²⁺ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca²⁺ signals within striatal astrocytes in situ.

Abstract

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca²⁺ concentration fluctuations ([Ca²⁺]_i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca²⁺]_i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca²⁺]_i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca²⁺]_i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca²⁺]_i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca²⁺]_i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca²⁺]_i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca²⁺]_i signals in the striatal microcircuitry.

Introduction

Astrozyten sind allgegenwärtig und reichlich Gliazellen des Gehirns. Es ist gut bekannt, dass Astrozyten dienen wichtige Unterstützung und homöostatischen Rollen einschließlich Pufferung der K ^{+ -Konzentration} in den extrazellulären Raum, Aufnahme von Neurotransmittern sowie Bereitstellung von Nährstoffen. Neuere Studien zeigen jedoch, dass sie [Ca ^2+] _i-Signale, die spontan auftreten und werden durch neuronale Aktivität ¹ erhöht zeigen auch. Die Existenz von Astrocyten [Ca ^2+] _{i-Signalisierung} wurde immer angenommen, dass die Kommunikation mit den Neuronen auslösen, und hat als solche als eine Form von "Ca ²⁺ Erregbarkeit" in Astrozyten interpretiert. Die verfügbaren Daten über die letzten zwei Jahrzehnte deuten zwei Einstellungen in dem Astrozyten und Neuronen kommunizieren kann, vielleicht in einer bidirektionalen Art und Weise. Ersten, Astrozyten reagieren häufig mit einer Zunahme der [Ca ^2+] _i, wenn sie von Neurotransmittern und AktivNeuromodulatoren von Neuronen ² veröffentlicht. Zweitens [Ca ^2+] _i steigt innerhalb Astrozyten bewirken die Freisetzung von Signalmolekülen aus Astrozyten, die wiederum Nervenzellen und Blutgefäße beeinflussen. Hinweise darauf, dass Moleküle aus Astrozyten Freigabe über Astrozyten-to-Neuron Signalisierungs Änderungen in den Funktionen der Synapsen, Schaltungen und schließlich ^3-5 Verhalten führen. Allerdings bleibt diese eine sich schnell entwickelnde Forschungsgebiet, und es wurde argumentiert, dass eine bessere und detailliertes Verständnis der Astrozyten [Ca ^2+] _i wird benötigt, um einige der derzeitigen Unsicherheiten ⁶ lösen.

In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass das Laden von mehreren organischen Ca ²⁺ Indikatorfarbstoffe in Astrozyten nicht zuverlässig zu erfassen [Ca ^2+] _i-Signale innerhalb gesamte Astrozyten in der Kultur und in situ ^7-10. Diese Ergebnisse wurden von uns und anderen ^6,11,12 diskutiert. Die Emerging Bild ist, dass [Ca ^2+] _i-Signale innerhalb Astrozyten Verfahren (zum Beispiel, Zweige und Ästchen), die die primären Standorte für Interaktionen mit Neuronen und Blutgefäße sind, haben nur selten im Detail erforscht. Vor kurzem hat die Anwendung genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren (GeCIS) wie zytosolischen GCaMP3, GCaMP5G und GCaMP6 und Plasmamembran tethered Versionen (zB Lck-GCaMP3) hat das Studium der [Ca2 ^+] _i-Signale in kleine Fächer von Astrozyten wie erlaubt so dünn Prozesse, in der Nähe der Plasmamembran und im gesamten Hoheitsgebiet zu ^7,8. Allerdings GeCIS einen Nachteil gegenüber organischen Ca ²⁺ Indikatorfarbstoffe und das ist die Voraussetzung für genetische Methoden, um die kodierenden Gene selektiv Astrozyten in vivo für Zeiträume von Wochen zu liefern für die GeCIS angemessen sein ausgedrückt. Expression in vivo wird typischerweise unter Verwendung von transgenen Mäusen erreicht, knock-in Mäuse oder mit Virus basierte Auslieferung AppKakerlaken. In der vorliegenden JoVE Artikel berichten wir Methoden und Verfahren eingesetzt, um GeCIS zu striatalen Astrozyten mit Adeno-assoziierten Viren liefern. Wir konzentrieren uns auf Cyto-GCaMP3 als ein Beispiel, aber die gleichen grundlegenden Verfahren funktioniert für jede andere GECI oder fluoreszierendes Protein basierten Reporter.

Protocol

Alle Tier Protokolle waren in Übereinstimmung mit den US National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der UCLA genehmigt. 1.1) Bereiten Mikropipette und AAV2 / 5 Virus Loading Verwenden Fein Borsilikatglas-Mikropipetten für die Injektion des Virus. Ziehen die Mikropipette unter Verwendung eines zweistufigen Zieh Programm mit einer vertikalen Magnet. Kegel die Pipette in einem W…

Representative Results

Für Astrozyten spezifische Expression von Cyto-GCaMP3 im Striatum, verwendeten wir Adeno-assoziierten Virus (AAV) des Serotyp 5 und die GFAP GfaABC 1 D-Promotors (1A), die zuvor gezeigt wurde, robuste und GCaMP3 Reportergen fahren Expression in hippokampalen und kortikalen Astrozyten 8,14. Zwei Wochen nach der Virusmikroinjektion in die Maus-Striatum wurde die Maus (~ 10 Wochen alt) perfundiert und IHC auf dünnen Hirnschnitten durchgeführt, um Cyto-GCaMP3 Expression im Striatum …

Discussion

Die hier beschriebenen Verfahren haben uns erlaubt, Zyto-GCaMP3 in striatalen Astrozyten in vivo für die anschließende [Ca ^2+] _i-Bildgebung in situ auszudrücken. Dieses Verfahren hat Vorteile gegenüber der Verwendung von transgenen oder Knockout-Mäusen, wie robust der Expression des Zielproteins, Geschwindigkeit und Flexibilität der experimentellen Durchführung und anatomischen Besonderheiten. Der Ausdruck GCaMP3 mit AAV2 / 5 wurde als spezifisch und robust. Die Kombination…

Materials

Syringe Pump	Harvard Apparatus	704506
Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Narishige	PC-10
Micropipette grinder	Narishige	EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3	Addgene	44331	a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
I mL syringe	BD	309628
syringe needle	BD	305109
AAV2/5 virus	UPenn vector core	NA
Sudan red IV	Sigma-Aldrich	67386
Mineral oil	CVS Pharmacy	152355
Cryostat	Leica	CM3050 S
Stereotaxic instrument	David Kopf Instruments	900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit	FOREDOM	K.1070
Paraformaldehyde	Santa cruz biotechnology	sc-281692
Super Glue	Krazy®Glue	KG925
Microslicer	Ted Pella	DTK-Zero 1
Confocal microscopes	Olympus	FV300 and FV1000
Normal goat serum	Vector	S-1000
chicken anti-GFP	Abcam	ab13970
mouse anti-s100β	Sigma-Aldrich	S2532
mouse anti-NeuN	Millipore	MAB377
mouse anti-glutamine synthetase	Millipore	MAB302
goat anti-mouse-Alexa546	Invitrogen	A11003
goat anti-chicken-Alexa488	Invitrogen	A11039
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5J
Mounting Medium	Vector	H-1000