Imaging intracellulaire Ca²⁺ Signalen in Striatale Astrocyten van volwassen muizen met behulp van genetisch gecodeerd Calcium Indicatoren

Summary

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca²⁺ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca²⁺ signals within striatal astrocytes in situ.

Abstract

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca²⁺ concentration fluctuations ([Ca²⁺]_i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca²⁺]_i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca²⁺]_i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca²⁺]_i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca²⁺]_i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca²⁺]_i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca²⁺]_i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca²⁺]_i signals in the striatal microcircuitry.

Introduction

Astrocyten alomtegenwoordig en overvloedig gliale cellen van de hersenen. Het staat vast dat astrocyten dienen vitale ondersteuning en homeostatische functies, waaronder buffering van K ⁺ concentratie in de extracellulaire ruimte, de opname van neurotransmitters, evenals het verstrekken van voedingsstoffen. Echter, recente studies tonen aan dat ze ook [Ca ^2+] _i signalen, die spontaan ontstaan ​​en worden verhoogd met neuronale activiteit ¹ weer te geven. Het bestaan ​​van astrocyten [Ca ^2+] _i signalering is steeds gedacht aan de communicatie met neuronen activeren en als zodanig is geïnterpreteerd als een vorm van "Ca ^{2 +} prikkelbaarheid" in astrocyten. De beschikbare gegevens over de laatste twee decennia suggereren twee standen waarin astrocyten en neuronen mogen, misschien in een bidirectionele wijze. Eerst, astrocyten reageren vaak met een stijging van [Ca _^2,] wanneer geactiveerd door neurotransmitters enneuromodulators vrijgelaten uit neuronen ^2. Tweede, [Ca ^2+] _i verhogingen astrocyten veroorzaakt het vrijkomen van signaalmoleculen van astrocyten die op hun beurt invloed neuronen en bloedvaten. Er zijn aanwijzingen dat moleculen vrijkomen van astrocyten leiden tot veranderingen in de functie van synapsen, circuits en uiteindelijk gedrag ^3-5 via astrocyten tot neuron signalering. Echter, dit blijft een snel groeiende onderzoeksgebied, en het is betoogd dat een beter en gedetailleerd inzicht in astrocyten [Ca ^2+] _i is nodig om een aantal van de huidige onzekerheden ⁶ lossen.

In vroeger werk, werd aangetoond dat het laden van bulk van organische Ca ²⁺ indicator kleurstoffen in astrocyten niet in slaagt om op betrouwbare wijze te detecteren [Ca ^2+] _i signalen binnen gehele astrocyten in de cultuur en in situ ^7-10. Deze bevindingen zijn besproken door ons en anderen ^6,11,12. De Emerging beeld is dat [Ca ^2+] _i signalen binnen astrocyten (bv, takken en twijgen), die de primaire sites voor interacties met neuronen en bloedvaten zijn, zijn zelden onderzocht in detail. Onlangs is het gebruik van genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) zoals cytosolische GCaMP3, GCaMP5G en GCaMP6 en plasmamembraan gebonden versies (bijvoorbeeld Lck-GCaMP3) heeft de studie van [Ca ^2+] _i signalen toegestaan ​​in kleine compartimenten van astrocyten, zo dun processen, in de buurt van het plasmamembraan en binnen de gehele gebieden ^7,8. Echter, GECIs één nadeel op organische Ca2 ⁺ indicator kleurstoffen en dat de vereiste genetische methoden om de coderende genen selectief leveren in astrocyten in vivo gedurende perioden van weken de GECIs adequaat zijn uitgedrukt. Expressie in vivo wordt meestal bereikt met behulp van transgene muizen, knock-in muizen of met virus gebaseerde levering appkakkerlakken. In de huidige Jupiter artikel rapporteren we methoden en procedures gebruikt om GECIs leveren aan het striatum astrocyten gebruik van adeno-geassocieerde virussen. Wij richten ons op cyto-GCaMP3 als voorbeeld, maar dezelfde basisprocedure werkt voor andere GECI of fluorescent eiwit gebaseerde reporter.

Protocol

Alle dierlijke protocollen waren in overeenstemming met de Amerikaanse National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de UCLA. 1.1) Bereid Micropipet en AAV2 / 5 Virus Laden Gebruik fijne borosilicaatglas micropipetten voor de injectie van het virus. Trek de micropipet met een tweestaps trekken programma met een verticale trekker. Bevel de pipet onder een hoek van 40 ° me…

Representative Results

Voor astrocyt specifieke expressie van cyto-GCaMP3 in het striatum, gebruikten we adeno-geassocieerd virus (AAV) van het serotype 5, en de GFAP GfaABC 1 D-promotor (figuur 1A), waarvan eerder aangetoond robuuste GCaMP3 en reportergen expressie in de hippocampus en corticale astrocyten 8,14. Twee weken na virus micro-injectie in de muis striatum, de muis (~ 10 weken oud) werd geperfundeerd en IHC werd uitgevoerd op dunne hersenen secties cyto-GCaMP3 expressie in het striatum <strong…

Discussion

De hierin beschreven werkwijzen hebben ons cyto-GCaMP3 in striatale astrocyten expressie in vivo voor daaropvolgende [Ca ^2+] _i beeldvorming in situ. Deze werkwijze heeft voordelen boven transgene of knock-in muizen, inclusief robuuste expressie van het doeleiwit, snelheid en flexibiliteit van de experimentele uitvoering en anatomische specificiteit. De expressie van GCaMP3 behulp AAV2 / 5 werd gevonden specifiek en robuust te zijn. De combinatie van GFAP GfaABC ₁ D prom…

Materials

Syringe Pump	Harvard Apparatus	704506
Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Narishige	PC-10
Micropipette grinder	Narishige	EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3	Addgene	44331	a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
I mL syringe	BD	309628
syringe needle	BD	305109
AAV2/5 virus	UPenn vector core	NA
Sudan red IV	Sigma-Aldrich	67386
Mineral oil	CVS Pharmacy	152355
Cryostat	Leica	CM3050 S
Stereotaxic instrument	David Kopf Instruments	900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit	FOREDOM	K.1070
Paraformaldehyde	Santa cruz biotechnology	sc-281692
Super Glue	Krazy®Glue	KG925
Microslicer	Ted Pella	DTK-Zero 1
Confocal microscopes	Olympus	FV300 and FV1000
Normal goat serum	Vector	S-1000
chicken anti-GFP	Abcam	ab13970
mouse anti-s100β	Sigma-Aldrich	S2532
mouse anti-NeuN	Millipore	MAB377
mouse anti-glutamine synthetase	Millipore	MAB302
goat anti-mouse-Alexa546	Invitrogen	A11003
goat anti-chicken-Alexa488	Invitrogen	A11039
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5J
Mounting Medium	Vector	H-1000