Protocol
Примечание: Все материалы приведены в таблице 1.
1. Хранение куриных эмбрионах
- Выдержите куриные яйца штамма Gallus Gallus горизонтально на 37 ° С с примерно 40% влажности и превратить яйца один или два раза в день. Обращаясь яйца важно для предотвращения эмбрион от присоединения к яичной скорлупы.
- Не превратить яйцо в 24 ч до создания культуры как в противном случае эмбрион будет расположен брюшной массы желтка и будут повреждены при открытии яйцо в шаге 3. Кроме того, держать яйца в 4 ° С градусов не более чем за одну неделю до инкубации «пресекать» развития, но это не является идеальным.
2. Постановка куриных эмбрионах
- Этап куриные эмбрионы, используя гамбургер и Гамильтон 12 промежуточной таблицы. Идеальная сцена для создания экс-ово культивирование HH этап 19-20 (около 3 дней инкубации) BECAUSE это вскоре после того, голова поворачивается на 53 часов после оплодотворения.
Примечание: HH этап 19-20 характеризуется следующими морфологическими признаками: сомиты распространяются в большинстве хвоста, однако самый конец хвоста остается сегментированный, хвостовой почки скручена, Аллантоис мала и ограничена сосудистой, для ног почки крупнее, чем крыло бутонов и глаза непигментированным или иметь сероватый оттенок.
3. Удаление эмбриона из оболочки
- Перед снятием эмбриона из оболочки, спрей оболочку с 70% этанола и дайте ему высохнуть. Не включайте яйцо быстро, как это может повредить зародыш.
- Соблюдая осторожность, чтобы не изменить ориентацию яйца, тщательно взломать яйцо на нижней стороне (т.е. сторона, которая была вентральной во время инкубации) и отпустите эмбриона в стерильной весят лодке (88 х 88 х 23 мм). Протрите весят лодки с 70% этанола. Проверьте эмбриона для того, чтобы желток мешок не повреждается. Если желтка чкак осколки, отказаться от эмбриона, так как он не выживет.
- Соблюдайте эмбриона для того, чтобы он жизнеспособен; Сердце бьется, сосудистая кажется нормальным, и никаких очевидных аномалий нет. Убедитесь, что края взвешивания лодке сухие.
- С помощью пипетки, падение 40 мкл пенициллина / стрептомицина (5000 единиц пенициллина, стрептомицина 5 мг на мл) на верхней части альбумина, чтобы помочь предотвратить инфекцию.
4. Подготовка влажность палату
- Поместите небольшую стопку КИМ-салфеток и / или абсорбирующей прокладки, изготовленной из хлопка в нижней части стерильной пластиковой емкости (12 х 12 х 6 см) протирают 70% -ным этанолом.
- Добавить стерильную дистиллированную воду, чтобы увлажнить КИМ-салфетки и / или хлопка (приблизительно 150 мл воды).
5. Сборка Ex ово Культура
- Поместите весить лодку, содержащий эмбриона в верхней части влажной прокладки. Затем место половина квадратного стерильную чашку Петри (9,5 х 9,5 см) в верхней части Тон весит лодку, чтобы сформировать свободную крышку.
- Накройте пластиковый контейнер с крышкой. Надавите на два угла крышкой, обеспечивая частичное уплотнение, которое до сих пор позволяет для хорошего воздушного потока внутри камеры.
- Осторожно положите установки в 37 ° С инкубатор до нужной стадии.
- Поместите контейнеры воды в инкубаторе, чтобы контролировать влажность, если контролируемое инкубатор влажности недоступен. Стерилизацию всю воду в камерах влажности и в инкубаторе и при необходимости пополнить в течение инкубационного периода. 40% влажности является идеальным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Это экс ово метода позволяет для наблюдения эмбрионов от ранних стадиях развития (чч 19/20) и поздних стадиях развития (чч 40-41) (рис 1А и 1В). Настройка культуру HH 19-20 увеличивает выживаемость эмбрионов в культуре. До головки поворота (до 53 HPF) живучесть очень низка в культуре и после стадии 21, эмбрион, как правило, придерживаться более к корпусу на удалении, так получают меньше интактные зародыши. В общем, живучесть эмбриона в экс ово культуры высотой до HH 35-36 (90-100%), но это не капля в более поздних стадиях развития (около 40% доживают до HH 40-41). Кроме того, хотя было показано, что развитие кажется нормальным при этих поздних стадиях и рисунка скелета не влияет 4,15, мы обнаружили, что конечности согнуты в этих поздних стадиях, предполагая, что степень или сроки оссификации могут быть затронуты. Этоне удивительно, учитывая необходимость кальция из скорлупы для окостенения. Подробное сравнение развития эмбриона по сравнению с контрольной группой продолжается, и выходит за рамки этого методы работы.
Получение доступа к эмбриона в ходе развития важно по двум основным причинам. Во-первых, исследователи могут просматривать развития на ежедневной основе, без того, чтобы распечатать и запечатать окна. Например, люди могут наблюдать конечности и развитию глаз на нескольких этапах (Рис 1С и 1D). Во-вторых, экс ово культивирования обеспечивает большую (неограниченный) доступ к эмбриона, что позволяет легче манипуляции или операции.
Эмбриональные манипуляции чаще, должны быть выполнены с использованием стереомикроскопа. Использование экс ово способа культивирования, описанной здесь, в отличие от пенополистирола методом / Plastic Wrap 6,7,8 эмбрион настройки легко помещается ундэ микроскоп, менее глубокий и не опрокинуться. Это дает возможность исследователю в положение камере влажности точно, как это необходимо, и повернуть его, чтобы оптимизировать доступ к эмбриона, так как не существует никаких препятствий (ичной скорлупы) закрывающие эмбрион и поскольку камера является очень стабильным. В целом, поддержка эмбрион получает от взвешивания лодки позволяет легкое давление, чтобы быть применены к эмбриона при манипулировании, не настройка опрокидывания.
Несколько развития методов биологии может проводиться на эмбрионах в этой системе культуры. Они включают в себя детальные наблюдения органа (например, глаз, головного мозга и т.д.) или развитие тканей (например, рост новых кровеносных сосудов) или применения тератогенных агентов. Манипуляции включают прививки тканей на хориоаллантойной мембран для изучения эффекта объединения различных слоев ткани или учебы рост опухоли и метастазирование 14. Другой популярный манипуляции выполняются во время развития BEAd или барьер имплантации. Бисера имплантация позволяет исследователю замочить ингибитор или фактор на шарик, а затем имплантировать шарик локально подавлять или стимулировать гены локально в области интереса. Это часто делается с помощью Affigel или гепарина бусы (рис 2а). Например, костные морфогенетические белки (BMPs) может быть локально ингибировать течение индукции нервного гребня, полученного костного 4, 15, или в развивающихся почки конечности 13. После шарик имплантировали эмбрион может быть возвращали в инкубатор и он будет продолжать развивать. Это позволяет исследователи, чтобы просмотреть ниже по течению эффекты ингибирования специфического гена (в данном случае BMP), такие как ингибирования образования склеры косточки в склеротических кольца (фиг.2В и 2С) 15. Аналогичным образом, барьеры могут быть легко вставлен между слоями ткани с целью изучения сигналов ткани к ткани-и микроинъекции красителей могут также легко быть проведен. 
Рисунок 1. Просмотр эмбриона экс ово. () HH этап 20 куриного эмбриона после извлечения из корпуса, стрелка указывает на эмбрион васкуляризированных зародышевых оболочек. (B) HH этап 40 эмбрионов в открытой камере влажности. (C) HH этап 35 эмбрионов, показывая ранние почки конечностей (стрелка). (D) Стадия HH 41 эмбрионов, показывая более поздней стадии развития таких структур, как глаз (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Пример Noggin пропитанной шарик имплантации ExperimЛОР 4. () эмбрионов HH этап 35 доступны через небольшое отверстие разорванной в вышележащих оболочек для того, чтобы получить доступ к основной глаз для бортовых имплантации. Высокое увеличение в Affigel борта смежной с конъюнктивальной сосочка показан на вставке. Бар Шкала в С 75 мкм. (B) щелочной фосфатазы окрашивали правый глаз после Noggin борта имплантации (стрелка), показывающие разрыв в кольце косточек, HH 38 (C) AP окрашивали левый глаз не показывая нарушения в кольце косточек (контроль ), HH 38. Детали этого эксперимента представлены в Duench и Франц-Odendaal 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Экс ово культивирование и оконной оба имеют свои преимущества и вызовы. Здесь мы сравнить преимущества и вызовы чашки экс пенополистирола ово метода и метода оконной к наш оптимизированный для экс ово способом, показанным здесь. Наш метод позволяет манипуляции и удобства наблюдения куриного эмбриона на поздних стадиях развития, и наши уточнений к традиционной экс ово метода 1, 2, 3 сделать это дополнительно очень проста в использовании в Вузовский лабораторных занятий.
Хотя многие исследователи предпочитают метод работы с окнами для изучения развития куриного, потому что это просто выполнить и имеет отличную живучесть поздних стадиях развития (HH 41-42), он имеет свои ограничения. Крупнейшим из которых является ограниченная способность смотреть весь эмбрион после HH стадии 30. После стадии HH 30, окна в яичной скорлупы должна быть очень большой, чтобы просмотреть растет, движется зародыш. Это большое окно является Difficult, чтобы запечатать полностью (что приводит к проблемам с бесплодием и живучести), а также получение хорошее освещение внутри яйца может быть сложной задачей. Кроме того, передовые эмбрионов на стадии большие и трудно получить доступ (или манипулировать) через окно.
Экс ово способом, описанным здесь предоставляет полный беспрепятственный доступ к эмбриона. После того, как вес лодки помещают в камеру влажности, весь набор вверх очень стабильна. Вся камера влажности могут быть помещены под микроскопом рассекает и высокое увеличение может быть использован для наблюдения весь эмбрион. Для сравнения, метод чашки пенополистирола имеет камеру влажности, что является высокий (высота чашки), и это делает его очень трудно поставить под целями микроскопа. Дизайн чашки также гораздо менее стабильны, чем плоские весят лодку, и эти чашки может быть легко опрокинул. Наши усовершенствования экс ово метода делают этот метод прост в использовании в классе или лаборатории обстановке и позволяет улudent иметь полный доступ к эмбрионов от стадии HH 19 через Его Высочеству 40; стадиях, когда основным органогенеза происходит. Самый большой недостаток нашего экс ово метода является бесплодие. Для того, чтобы предотвратить инфекцию, наш метод включает добавление антибиотиков. Другой дозу антибиотика могут быть предоставлены эмбриона на более поздних этапах. Антибиотики вводят во время культуры настройке и, кажется, не влияет на развитие эмбриона. Стерилизация контейнеров с 70% этанола до использования может значительно увеличить живучесть.
В целом, экс ово метод является идеальным для просмотра и манипулирования эмбрионов без ограничений по доступу или стадии развития. Предыдущие исследования показали, что культивирование эмбрионов экс ово не влияет отрицательно рисунка 4,15. Например, мы не видим каких-либо изменений в формировании паттерна или индукции скелета, несмотря на отсутствие скорлупы. Наша усовершенствованный способ решает несколько Challenges, которые существуют с текущей традиционной экс ово метода 1,2, 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы в отношении информации, представленной в этой рукописи.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Поль Пуарье, средства массовой информации производителей, на горе Сент-Винсент университета за его работу в съемках и редактирования видео часть этой рукописи. Мы признаем естествознания и техники Научно-исследовательского совета Канады для финансирования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
- Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
- Dorrell, M. I., et al. Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development. American Biology Teacher. 74 (9), (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88, 49-92 (1951).
- Drossopoulou, G., et al. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling. Development. , 127-1337 (2000).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Franz-Odendaal, T. Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus. Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).
