Protocol
Not: Tüm malzemeleri Tablo 1'de verilmiştir.
1. Tavuk Embriyolar Saklama
- Yaklaşık% 40 nem ile Gallus 37 o C yatay Gallus gerginlik tavuk yumurta inkübe ve bir kez ya da günde iki kez yumurta açın. Yumurta kabuğu Torna yapışmasını embriyo önlemek için önemlidir.
- 4 o C'de yumurta tutmak, önceki aksi embriyo sarısı kitle ventral yer alacak ve ek olarak 3. adımda yumurta açılması zarar görür gibi kültür kurma 24 saat içinde yumurta açmak etmeyin "halt" kalkınma inkübasyon öncesinde en fazla bir hafta derece ama bu ideal değildir.
2. Tavuk Embriyolar Sahneleme
- Hamburger ve Hamilton 12 evreleme tablosunu kullanarak tavuk embriyoları Sahne. Eski-ovo kültürlenmesini kurmak için ideal bir sahne HH evre 19-20 (inkübasyon 3- etrafında gün) bec olduğunuause Bu kafa 53 hpf döner kısa bir süre sonra olduğunu.
Not: HH evre 19-20 aşağıdaki morfolojik özellikleri ile karakterize edilir: Somitlerin kuyruk çoğunluğu içine uzatılır, ancak kuyruk çok uç kuyruk tomurcuk kıvrılmış, bölünmemiş kalır, allantois küçük ve damarsal sınırlıdır, bacak-tomurcuklar kanat-tomurcuklar daha büyük ve gözler pigmentlenmemiş veya grimsi bir renk var.
3. Shell Embriyo Çıkarma
- Kabuktan embriyo çıkarmadan önce,% 70 etanol ile kabuk sprey ve kurumaya bırakın. Bu embriyo zarar verir gibi hızla yumurta açmayın.
- Dikkatli olmak dikkatli alt tarafında yumurta çatlak, yumurta yönünü değiştirmek için değil (yani, inkübasyon sırasında ventral oldu tarafı) ve steril içine embriyo serbest tekne (88 x 88 x 23 mm) tartın. Silin% 70 etanol ile tekneler tartın. Yumurta sarısı çuval zarar görmediğinden emin olmak için kontrol edin embriyo. Yumurta sarısı h Eğerkırık gibi hayatta olmayacak gibi, embriyo atın.
- O canlı olmasını sağlamak için embriyo uyun; Kalp atıyor, damar normal görünür, ve hiçbir belirgin anormallikler mevcuttur. Tartmak tekne kenarları kuru olduğundan emin olun.
- Bir pipet kullanarak, enfeksiyonu önlemek için albümin üzerine penisilin / streptomisin, 40 ul (5.000 birim penisilin, ml başına 5 mg streptomisin) bırakın.
4. Nem Odası Hazırlama
- Kim-mendil ve / veya bir steril plastik konteynerin (12 x 12 x 6 cm ebadında), alt pamuk emici bir ped küçük bir deste koyun,% 70 etanol ile silinmiştir.
- Kim-mendil ve / veya pamuk su (yaklaşık 150 mi) biraraya getirildi steril damıtılmış su ilave edin.
5. Ex Ovo Kültür Montaj
- Nemli dolgu üstüne embriyo içeren tartmak tekne yerleştirin. Ardından, t üstünde bir kare steril petri kabına (9.5 x 9.5 cm) yeri yarısıO gevşek kapak oluşturmak için tekne tartın.
- Onun kapaklı plastik kap örtün. Hala odasının içine iyi hava akışı sağlar kısmi mühür sağlanması, kapağın iki köşeleri aşağıya doğru bastırın.
- Dikkatle istenilen aşamaya kadar 37 o C inkübatör içine kurulum yerleştirin.
- Kontrollü nem inkübatör kullanılamaz ise, nem kontrolü yardımcı inkübatör su kapları yerleştirin. Nem odalarında ve inkübatör tüm suyu sterilize ve kuluçka döneminde gerektiği gibi doldurun. % 40 nem ideal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yöntemin ovo Bu eski geç gelişim evrelerinde (HH 40-41) (Şekil 1A ve 1B) gelişme erken aşamalarında (HH 19/20) embriyoların gözlem için izin verir. HH 19-20 de kültür kurma kültür embriyoların beka artırır. Hayatta kalma kültürü ve sahnede 21 sonra çok düşüktür (53 hpf önce) çevirerek kafasına önce, embriyo daha az sağlam embriyolar elde edilir, böylece kaldırılması üzerine kabuk daha sopa eğilimindedir. (Yaklaşık% 40 HH 40-41 kadar hayatta) Genel olarak, kültür ex ovo embriyonun beka HH 35-36 (% 90-100) kadar yüksek, ama gelişme daha ileri aşamalarında düşüyor. Bu gelişme göstermiştir olmasına rağmen Ayrıca, bu geç evrelerde normal görünür ve iskeletin desenlendirme 4,15 etkilenmez, biz bacaklarda kemikleşme derecesi veya zamanlaması etkilenmiş olabileceğini düşündürmektedir bu son aşamada bükülmüş olduğunu gözlemledik. Buşaşırtıcı değil kemikleşme için kabuk kalsiyum ihtiyacını göz önünde bulundurarak. Kontrollere göre embriyonun gelişimi ayrıntılı bir karşılaştırma devam etmektedir ve bu yöntemler yazının kapsamı dışındadır.
Gelişim boyunca embriyo erişim sağlamanın iki ana nedenden dolayı önemlidir. İlk olarak, araştırmacılar açmak ve bir pencere yeniden mühürlemek zorunda kalmadan günlük bazda gelişimini görmek mümkün. Örneğin, bireylerin birden fazla aşamada (Şekil 1C ve 1D) de uzuv ve göz gelişimini gözlemlemek mümkün. İkincisi, kültürleme ex ovo, embriyo daha (sınırsız) erişim sağlar ve böylece daha kolay manipülasyonlar veya ameliyatlar sağlayan.
Embriyonik manipülasyonlar genellikle, bir stereomikroskop kullanılarak gerçekleştirilmesi gerekir. Strafor / plastik wrap yöntemine 6,7,8 aksine burada açıklanan kültür yöntemiyle ovo eski kullanılarak set-up kolayca und yerleştirilir embriyoer mikroskop, daha az derin ve devrilebilir olmaz. Embriyo engellemeyecek hiçbir engel (yumurta kabuğu) olmadığından ve oda çok kararlı olduğundan bu, gerekli ve embriyo erişimi optimize etmek döndürmek için tam nem odasını yerleştirmek için araştırmacı sağlar. Genel olarak, embriyo tartmak tekne aldığı destek nazik basınç set-up devrilmesini olmadan manipülasyon sırasında embriyo uygulanacak sağlar.
Çeşitli gelişim biyolojisi yöntemleri bu kültür sisteminde embriyolara üzerinde yapılabilir. Bunlar detaylı organ gözlemler (örneğin, göz, beyin vb) veya teratojenik ajanlar doku gelişimini (örneğin, kan damarı büyümesi) veya uygulamayı içermektedir. Manipülasyonlar farklı doku katmanları birleştirerek veya tümör büyümesini ve metastazı 14 okuyan etkisini incelemek için koriyoallantoik membranlar üzerine dokuların greftleme içerir. Gelişimi sırasında yapılan başka popüler manipülasyon bea olduğunud veya bariyer implantasyon. Boncuk implantasyon araştırmacı inhibe veya ilgi alanında yerel genleri ikna etmek için yerel boncuk boncuk üzerine bir inhibitörü veya faktör ıslatın ve sonra implant sağlar. Bu genellikle Affigel veya heparin boncuklar (Şekil 2A) kullanılarak yapılır. Örneğin, kemik morfogenetik proteinleri (BMP) yerel kemik 4, 15 türetilmiş nöral krest indüksiyon sırasında önlenebilir veya gelişmekte olan ekstremitede 13 tomurcuk. Bir kordon implante edildikten sonra embriyo inkübatöre geri edilebilir ve geliştirmeye devam edecektir. Bu araştırmacılar, sklerotik halkada skleral kemik parçası oluşumunun engellenmesi (Şekil 2B ve 2C), 15 olarak, (bu durumda BMP), belirli bir genin engellenmesi alt baş etkilerini görmek için izin verir. Benzer şekilde, bariyer kolayca doku-doku sinyal ve boyalar mikroenjeksiyon de kolayca yapılabilir incelemek üzere ince kağıt tabakası arasına sokulabilir. 
Embriyo ex ovo Görüntüleme Şekil 1.. (A) HH evre kabuk çıkarıldıktan sonra 20 civciv embriyo, vaskülarize embriyonik membranlar ile embriyo ok puan. (B) A HH evre açık nem odasında 40 embriyo. (C) HH evre erken ekstremite tomurcukları (ok) gösteren 35 embriyo. (D), göz (ok) olarak yapıların daha sonra sahne gelişme gösteren Sahne HH 41 embriyo. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Noggin Şekil 2. Örnek İmplantasyon Experim boncuk batırılmışent 4. (A) Embriyo HH evre 35 boncuk implantasyonu için altta yatan göz erişmek için örten zarlarda yırtık küçük bir delikten maruz. Bir konjonktiva papilla bitişik Affigel boncuk Yüksek büyütme içerlek gösterilir. C Ölçek çubuğu 75 mm. (B) alkalen fosfataz kemiklerinin halka boşluğu gösteren Noggin boncuk implantasyonu (ok), kemiklerinin halka hiçbir bozulma gösteren HH 38 (C) AP lekeli sol göz (kontrol sonrası sağ gözünü lekeli ), bu deney 38. Ayrıntılar Duench ve Franz-Odendaal 4 verilmiştir SS. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kültürleme ve her ikisi de pencereleme ex ovo avantajları ve zorlukları vardır. Burada avantaj ve yöntem ovo Strafor bardak ex ve burada gösterilen yönteme ovo Optimize ex pencere yöntemi zorlukları karşılaştırın. Bizim yöntem geç gelişim evrelerinde ve yöntem 1, 2 ovo geleneksel ex bizim ayrıntılandırmaları de manipülasyon ve civciv embriyo rahatlıkla izlenebilmektedir, 3 lisans öğretim laboratuvar derslerinde kullanmak üzere, ek çok kolay.
Bunu gerçekleştirmek için basit ve gelişim geç evrelerinde (HH 41-42) mükemmel beka çünkü birçok araştırmacı tavuk gelişimini incelemek için pencere yöntemi tercih olsa da, sınırlamaları vardır. hangi büyük aşamasından sonra HH HH 30 evre 30 sonra tüm embriyo görüntülemek için sınırlı yeteneği, yumurta kabuğu pencere büyüyen, hareketli embriyo görmek için çok büyük olması gerekir. Bu büyük pencere fark olduğunuicult tamamen (kısırlık ve beka ile sorunlara yol açan), ve zor olabilir yumurta içinde iyi aydınlatma elde mühür. Buna ek olarak, ileri evre embriyolar pencereden büyük ve ulaşılması zor (veya işlemek) vardır.
Burada tarif edilen yöntemle ex ovo embriyo tam sınır tanımayan erişim sağlar. Ağırlık tekne nem odasına yerleştirilir sonra, tamamı için çok kararlıdır. tün nem odası bir mikroskop altında yerleştirilebilir ve böylece yüksek büyütme tüm embriyo gözlemlemek için kullanılabilir. Buna karşılık, Strafor kap yöntemi uzun boylu bir nem odası (fincan yükseklik) sahiptir ve bu çok zor mikroskop hedefleri altına yerleştirmek için yapar. fincan tasarımı tekne tartmak da çok daha az kararlı düz daha ve bu bardak kolayca devirir olabilir. Yönteme ex ovo Bizim iyileştirmeler bir sınıf ya da laboratuar ortamında kullanmak için bu yöntem basit hale ve st sağlarHH 40 kadar sahnede HH 19 embriyolar tam erişim için udent; büyük organogenezisin oluştuğu zaman aşamaları. yöntemin ovo bizim eski en büyük dezavantajı kısırlık olduğunu. Enfeksiyonu önlemek amacıyla, bizim yöntem antibiyotik eklenmesini içerir. Antibiyotik bir doz daha sonraki aşamalarında embriyo verilebilir. Kültür set-up sırasında uygulanan antibiyotikler de embriyonun gelişimini etkilediği görünmüyor. Dramatik beka artırabilir kullanmak için önce% 70 etanol ile kapları sterilize.
Genel olarak, yöntemin ex ovo gelişimi erişim veya sahnede kısıtlaması olmaksızın embriyolar görüntüleme ve işlenmesi için idealdir. Önceki araştırmalar embriyolar ex ovo kültürleme olumsuz 4,15 desenlendirme etkilemez göstermiştir. Örneğin, biz yumurta kabuğu olmamasına rağmen desenleme veya iskeletin indüksiyon herhangi bir değişiklik görmüyorum. Bizim gelişmiş yöntem birden c çözeryöntemiyle 1,2, 3 ovo mevcut geleneksel eski ile mevcut hallenges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu yazının sunulan bilgilere açısından hiçbir rakip mali çıkarlarını var.
Acknowledgments
Biz onun filme iş ve bu yazının video bölümünü düzenlemek için Mount Saint Vincent Üniversitesi Paul Poirier, Medya Yapımcı, teşekkür etmek istiyorum. Biz finansman için Kanada Doğal Bilim ve Mühendislik Araştırma Konseyi kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
- Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
- Dorrell, M. I., et al. Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development. American Biology Teacher. 74 (9), (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88, 49-92 (1951).
- Drossopoulou, G., et al. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling. Development. , 127-1337 (2000).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Franz-Odendaal, T. Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus. Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).
