Protocol
Bemærk: Alle leverancer er anført i tabel 1.
1. Opbevaring af kyllingeembryoner
- Inkuber hønseæg af stammen Gallus gallus horisontalt ved 37 ° C med ca. 40% fugtighed og drej æg én eller to gange dagligt. Turning æg er vigtigt at forhindre embryo klæbe til æggeskallen.
- Må ikke at vende ægget i 24 timer forud for opsætning af kultur som ellers embryoet vil blive placeret ventrale til blommen masse og vil blive beskadiget ved åbning af ægget i trin 3. Desuden holde æggene ved 4 o C grader for ikke mere end en uge før inkubation til "stå" udvikling, men det er ikke ideelt.
2. Iscenesættelse kyllingeembryoner
- Stage kylling embryoner ved hjælp af Hamburger og Hamilton 12 iscenesættelse bordet. Den ideelle scene for at oprette ab ovo dyrkning er HH stadie 19-20 (ca. 3 dages inkubation) becABrug dette er kort efter hovedet vender ved 53 HPF.
Bemærk: HH stadie 19-20 er kendetegnet ved følgende morfologiske træk: somitter forlænges i størstedelen af halen, men den bitre ende af halen forbliver unsegmented, halen opløbet er krøllet, allantois er lille og har begrænset kar, ben-knopper er større end de fløj-knopper og øjnene er upigmenteret eller har en grålig nuance.
3. Fjernelse af Embryo fra Shell
- Inden du fjerner embryo fra skallen, spray skallen med 70% ethanol og lad det tørre. Drej ikke ægget hurtigt, da dette vil beskadige embryoet.
- At være omhyggelig med ikke at ændre orienteringen af ægget forsigtigt knække ægget på undersiden (dvs. den side, der var ventral under inkubation), og slip embryo i en steril vejer båd (88 x 88 x 23 mm). Tør ned vejer både med 70% ethanol. Undersøg embryo at sikre, at blommesækken ikke er beskadiget. Hvis æggeblomme hsom brudt, kassere fosteret, da det ikke vil overleve.
- Overhold embryonet at sikre, at den er levedygtig; hjertet slår, kar forekommer normalt, og ingen indlysende abnormiteter er til stede. Kontroller, at kanterne af veje båden er tørre.
- Ved hjælp af en pipette, drop 40 pi penicillin / streptomycin (5.000 enheder penicillin, 5 mg streptomycin pr ml) på toppen af albumin for at forhindre infektion.
4. Forberedelse af fugtighedskammeret
- Placer en lille stak KIM-klude og / eller en absorberende pude fremstillet af bomuld i bunden af en steril plastbeholder (12 x 12 x 6 cm) aftørres med 70% ethanol.
- Tilføj sterilt, destilleret vand til at fugte KIM-klude og / eller bomuld (ca. 150 ml vand).
5. Montering af Ex Ovo Kultur
- Placer vejebåd indeholdende embryo oven på fugtige polstring. Derefter sted halvdelen af en kvadratisk steril petriskål (9,5 x 9,5 cm) oven på than vejer båd til at danne en løs låg.
- Dæk plastbeholder med låg. Tryk ned to hjørner af låget, hvilket sikrer en delvis tætning, som stadig giver mulighed for god luftcirkulation inde i kammeret.
- Placer forsigtigt setup i 37 ° C inkubator indtil den ønskede scene.
- Placer beholdere med vand i inkubatoren til at kontrollere luftfugtigheden, hvis en kontrolleret fugtighed inkubator er ikke tilgængelig. Steriliseres alt vand i luftfugtighed kamre og i inkubatoren og genopbygge efter behov i inkubationsperioden. 40% fugtighed er ideelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne ex ovo metode giver mulighed for observation af embryoner fra tidlige udviklingsstadier (HH 19/20) til sene stadier af udvikling (HH 40-41) (Figur 1A og 1B). Opsætning af kulturen på HH 19-20 øger overlevelsesevne embryonerne i kulturen. Forud for hoved drejning (før 53 HPF) overlevelsesevne er meget lav i kultur, og efter trin 21, embryonet har tendens til at holde sig mere til skallen på fjernelse så færre intakte fostre opnås. Generelt overlevelsesevne embryoet i ex ovo kultur er højt op til HH 35-36 (90-100%), men det gør fald i de mere fremskredne stadier af udvikling (ca. 40% overlever til HH 40-41). Derudover, selv om det er påvist, at udviklingen ser normal på disse sene stadier og mønster af skelettet er upåvirket 4,15, har vi observeret, at lemmerne er bøjet på disse sene stadier tyder på, at graden af eller tidspunktet for ossifikation kan blive påvirket. Dette erikke overraskende i betragtning af behovet for calcium fra skallen for ossifikation. En detaljeret sammenligning af udviklingen af embryo sammenlignet med kontroller er i gang, og er uden for rammerne af denne metoder papir.
Få adgang til fosteret gennem udvikling er vigtig af to grunde. Først forskerne i stand til at se udvikling på daglig basis uden at skulle bryde forseglingen og forsegle et vindue. For eksempel, er individer i stand til at observere lemmer og øjne udvikling på flere trin (figur 1C og 1D). For det andet, ex ovo dyrkning giver større (ubegrænset) adgang til embryonet, hvorved lettere manipulationer eller operationer.
Embryonale manipulationer oftest skal udføres under anvendelse af et stereomikroskop. Brug af ex ovo dyrkning beskrevet her i modsætning til Styrofoam / plastikfolie metode 6,7,8 metode embryoet set-up er let placeret undER mikroskopet, er mindre dyb og vil ikke vælte. Dette gør det muligt for forskeren at placere fugtighedskammer præcist som nødvendigt og at rotere det at optimere adgang til embryo, da der ikke er nogen hindringer (æggeskal) tilslører embryonet og da kammeret er meget stabil. Samlet støtte embryo modtager fra vejebåd tillader let tryk, der skal anvendes til embryo under manipulation uden opsætningen vælte.
Kan der gennemføres flere udviklingsmæssige biologi metoder på embryoner i denne kultur system. Disse omfatter detaljerede observationer af orgel (f.eks øjne, hjerne osv) eller væv udvikling (f.eks blodkarvækst) eller anvendelsen af teratogene stoffer. Manipulationer omfatter podning af væv onto fosterhinder at undersøge virkningen af at kombinere forskellige vævslag eller studere tumorvækst og metastase 14. En anden populær manipulation udført under udviklingen er bead eller barriere implantation. Perler implantation tillader en forsker at suge en inhibitor eller faktor på perlen og derefter implantere perlen lokalt for at hæmme eller inducere gener lokalt i området af interesse. Dette sker ofte ved hjælp af Affigel eller heparin perler (figur 2A). For eksempel kan knoglemorfogenetiske proteiner (BMP'er) være lokalt inhiberes under induktion af neural crest afledt knogle 4, 15 eller i udviklingslandene knopskydninger 13. Efter en perle er implanteret, kan embryoet returneres til inkubatoren, og det vil fortsætte med at udvikle sig. Dette gør det muligt for forskerne at se de efterfølgende virkninger af inhiberingen af et bestemt gen (i dette tilfælde BMP), såsom inhibering af scleral ossicle dannelse i sklerotiske ring (figur 2B og 2C) 15. Ligeledes kan let indsættes barrierer mellem vævslag for at studere væv-til-væv-signalering og kan også let udføres mikroinjektion af farvestoffer. 
Figur 1. Visning af embryo ex ovo. (A) HH trin 20 chick embryo efter fjernelse fra skallen, pilen peger på foster med vaskulariserede embryonale membraner. (B) en HH stage 40 embryo i en åben fugtighed kammer. (C) HH trin 35 embryo viser tidlige lemmer knopper (pil). (D) Stage HH 41 embryo viser senere udviklingsstadium strukturer såsom øjet (pil). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Eksempel på Noggin gennemblødt perle Implantation Experiment 4. (A) Embryo HH trin 35 blotlagt gennem en lille hul revet i de overliggende membraner med henblik på at få adgang til den underliggende øje for perle implantation. Stor forstørrelse af Affigel perle støder op til en konjunktival papilla er vist i inset. Scale bar i C er 75 um. (B) Alkalisk phosphatase farvet højre øje efter Noggin perle implantation (pil), der viser hul i ringen af ossicles, HH 38 (C) AP farvede venstre øje, der viser nogen afbrydelse til ringen af ossicles (kontrol ), HH 38. Detaljer af dette eksperiment er tilvejebragt i Duench og Franz-Odendaal 4. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex ovo dyrkning og windowing begge har fordele og udfordringer. Her sammenligner vi fordele og udfordringer i Styrofoam kop ex ovo metode og vinduesystemet metode til at vores forbedrede ex ovo metode er vist her. Vores metode gør manipulation og let observation af chick embryo på sene stadier af udvikling og vores finjusteringer af traditionelle ex ovo metode 1, 2, 3 gør det desuden meget let at bruge i prægraduat undervisning laboratorieøvelser.
Selv om mange forskere foretrækker vinduesystemet metode til at studere kylling udvikling, fordi det er enkelt at udføre, og har fremragende overlevelsesevne til sene stadier af udvikling (HH 41-42), det har sine begrænsninger. Den største er den begrænsede evne til at se hele embryo efter HH etape 30. Efter trin HH 30, vinduet i æggeskallen skal være meget store for at kunne se den voksende, bevægelige foster. Denne store vindue er difficult at forsegle fuldstændigt (hvilket fører til problemer med sterilitet og overlevelsesevne), og opnå god belysning inde i ægget kan være udfordrende. Desuden avancerede embryoer er store og vanskelige at få adgang (eller manipulere) gennem vinduet.
Ex ovo metode beskrevet her giver fuld uhæmmet adgang til fosteret. Når vejebåd placeres i fugtighedskammeret, hele set-up er meget stabil. Hele fugtighedskammer kan placeres under et dissektionsmikroskop og stor forstørrelse kan bruges til at observere hele embryoet. Til sammenligning Styrofoam cup metode har et fugtighedskammer, der er høj (cup højde), og dette gør det meget vanskeligt at placere under mikroskop mål. Koppen design er også langt mindre stabil end den flade veje båden og disse kopper kan nemt vælte. Vores forbedringer af ex ovo metode gør denne metode ligetil at bruge i et klasseværelse eller lab indstilling og giver student at få fuld adgang til embryoner fra scenen HH 19 igennem til HH 40; stadier, når den organdannende forekommer. Den største ulempe ved vores ex ovo metode er sterilitet. For at forhindre infektion, vores metode omfatter tilsætning af antibiotika. En anden dosis af antibiotika kan gives til embryoet på et senere tidspunkt. De antibiotika, der administreres under dyrkning set-up også synes ikke at påvirke udviklingen af embryoet. Sterilisering beholdere med 70% ethanol før brug kan dramatisk øge overlevelsesevne.
Samlet set ex ovo metode er ideel til visning og manipulere embryoner uden begrænsninger i adgangen og udviklingsstade. Tidligere forskning har vist, at dyrkning af embryoner ex ovo ikke negativ indflydelse mønstring 4,15. For eksempel ser vi ikke nogen ændringer i mønstret eller induktion af skelettet trods manglende æggeskallen. Vores forbedrede metode løser flere cUDFORDRINGER der findes med den nuværende traditionelle ex ovo metode 1,2, 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser i forhold til de oplysninger, der præsenteres i dette manuskript.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Paul Poirier, Medier Producer, på Mount Saint Vincent University for hans arbejde i at filme og redigere video del af dette manuskript. Vi anerkender Natural Science and Engineering Research Council of Canada til finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
- Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
- Dorrell, M. I., et al. Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development. American Biology Teacher. 74 (9), (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88, 49-92 (1951).
- Drossopoulou, G., et al. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling. Development. , 127-1337 (2000).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Franz-Odendaal, T. Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus. Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).
