Protocol
Opmerking: Alle leveringen zijn opgenomen in tabel 1.
1. Het opslaan van de kippenembryo's
- Incubeer kippeneieren van de stam Gallus gallus horizontaal bij 37 ° C met ongeveer 40% vochtigheid en draai eieren of tweemaal daags. Het draaien van de eieren is belangrijk om te voorkomen dat het embryo uit het naleven van de eierschaal.
- Niet om het ei draaien in de 24 uur voorafgaand aan het opzetten van de kweek anders de embryo zich ventraal van de dooier massa en beschadigd het openen van de eieren in stap 3. Bovendien houden de eieren bij 4 ° C graden voor niet meer dan één week voor incubatie "halt" ontwikkeling, maar dit is niet ideaal.
2. Staging kippenembryo's
- Stadium de kippenembryo's met behulp van de Hamburger en Hamilton 12 stagingtabel. De ideale podium voor het opzetten van de ex-ovo kweken is HH stadium 19-20 (ongeveer 3 dagen incubatie) because dit is kort na het hoofd draait op 53 HPF.
Opmerking: HH stadium 19-20 wordt gekenmerkt door de volgende morfologische kenmerken: somites worden uitgebreid naar de meerderheid van de staart, maar het einde van de staart blijft unsegmented, de staart kiem is gekruld, de allantois is klein en heeft vaatstelsel beperkt, het been-knoppen zijn groter dan de vleugel-knoppen en de ogen zijn ongepigmenteerde of hebben een grijsachtige tint.
3. Het verwijderen van het Embryo van de Shell
- Voordat u het embryo uit de schelp, spuit de shell met 70% ethanol en laat ze drogen. Laat het ei niet draaien snel, omdat dit het embryo zal beschadigen.
- En let niet te veranderen van de oriëntatie van het ei, zorgvuldig barst het ei aan de onderkant (dat wil zeggen, de kant die ventrale tijdens incubatie was) en laat het embryo in een steriele wegen boot (88 x 88 x 23 mm). Vegen van wegen boten met 70% ethanol. Inspecteer het embryo dat de dooierzak niet beschadigd. Als de dooier hals gebroken, gooi het embryo, omdat het niet zal overleven.
- Observeer het embryo te zorgen dat het levensvatbaar is; het hart klopt, verschijnt vaatstelsel normaal, en geen duidelijke afwijkingen aanwezig zijn. Zorg ervoor dat de randen van de wegen boot droog zijn.
- Met behulp van een pipet, drop 40 ul van penicilline / streptomycine (5.000 eenheden penicilline, 5 mg streptomycine per ml) op de top van de albumine te helpen infectie te voorkomen.
4. Voorbereiding van de vochtigheid kamer
- Plaats een kleine stapel kim-doekjes en / of een absorberend kussen van katoen in de bodem van een steriele plastic houder (12 x 12 x 6 cm) afgeveegd met 70% ethanol.
- Voeg steriel, gedestilleerd water aan de kim-doekjes en / of katoen (ongeveer 150 ml water) te bevochtigen.
5. Montage van de Ex Ovo Cultuur
- Plaats de gewichtboot waarin het embryo bovenop de vochtige vulling. Vervolgens plaats helft van een vierkante steriele petrischaal (9.5 x 9.5 cm) bovenop tHij boot weegt om een losse deksel vormen.
- Bedek de plastic container met het deksel. Druk de twee hoeken van het deksel, zorgen voor een gedeeltelijke afsluiting die nog steeds zorgt voor een goede luchtstroom in de kamer.
- Plaats de setup voorzichtig in de 37 o C incubator totdat de gewenste podium.
- Plaats containers van water in de incubator helpen de vochtigheid, indien een gecontroleerde luchtvochtigheid incubator niet beschikbaar. Steriliseer alle water in de kamers en vochtigheid in de incubator en vul indien nodig gedurende de incubatieperiode. 40% luchtvochtigheid is ideaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze ex ovo methode maakt het mogelijk voor de observatie van embryo's uit de vroege stadia van ontwikkeling (HH 19/20) tot de late stadia van ontwikkeling (HH 40-41) (Figuur 1A en 1B). Het opzetten van de cultuur bij HH 19-20 verhoogt de overlevingskansen van de embryo's in de cultuur. Voorafgaand aan de kop te draaien (vóór 53 HPF) overlevingskansen is zeer laag in de cultuur en na etappe 21, het embryo heeft de neiging om meer te houden aan de shell op verwijdering dus minder intacte embryo's worden verkregen. In het algemeen overlevingsvermogen van het embryo in ex ovo cultuur hoog HH 35-36 (90-100%), maar wel daling in de latere stadia van ontwikkeling (ongeveer 40% overleven HH 40-41). Bovendien, hoewel aangetoond is dat de ontwikkeling normaal lijkt bij deze late stadia en patroonvorming van het skelet niet beïnvloed 4,15, hebben we vastgesteld dat de ledematen gebogen naar deze late stadia suggereert dat de mate of timing van verbening kan worden beïnvloed. Dit isniet verwonderlijk, gezien de behoefte aan calcium uit de shell voor botvorming. Een gedetailleerde vergelijking van de ontwikkeling van het embryo in vergelijking met controles onderweg en valt buiten het bestek van deze methoden paper.
Het verkrijgen van toegang tot het embryo tijdens de ontwikkeling is om twee belangrijke redenen. Ten eerste, de onderzoekers zijn in staat om de ontwikkeling te bekijken op een dagelijkse basis, zonder te hoeven unseal en sluit een venster. Bijvoorbeeld, mensen zijn in staat om ledematen en ogen ontwikkeling te observeren op meerdere podia (figuur 1C en 1D). Ten tweede, ex ovo kweken zorgt voor een grotere (onbeperkte) toegang tot het embryo, waardoor het mogelijk makkelijker manipulaties of ingrepen.
Embryonale manipulaties meestal, moeten worden uitgevoerd met een stereomicroscoop. De ex ovo kweken hier beschreven methode in tegenstelling tot de Styrofoam / plastic werkwijze 6,7,8 embryo opstelling wordt gemakkelijk und geplaatstre van de microscoop, is minder diep en zal niet omvallen. Hierdoor kan de onderzoeker de vochtige kamer precies positioneren als nodig en te draaien om toegang tot het embryo optimaliseren, aangezien er geen belemmeringen (eierschaal) verduistert het embryo en omdat de kamer is zeer stabiel. Kortom, de drager de embryo ontvangt van de gewichtboot laat lichte druk wordt uitgeoefend op de embryo tijdens manipulatie zonder opzet omvallen.
Verschillende ontwikkelingsbiologie methoden kunnen worden uitgevoerd op de embryo's in deze cultuur systeem. Deze omvatten gedetailleerde observaties van orgel (bv ogen, hersenen etc) of weefsel ontwikkeling (bijvoorbeeld de groei van bloedvaten) of de toepassing van teratogene agenten. Manipulaties omvatten enten van weefsel op de chorion membranen om het effect van het combineren van verschillende weefsellagen of studeren tumorgroei en metastase 14 bestuderen. Een andere populaire manipulatie uitgevoerd tijdens de ontwikkeling is bead of slagboom implantatie. Kraal implantatie kan een onderzoeker naar een remmer of factor genieten op de hiel en dan implanteren de kraal lokaal om te remmen of induceren genen lokaal in het gebied van belang. Dit gebeurt vaak met Affigel of heparine korrels (Figuur 2A). Bijvoorbeeld, kan bot morfogenetische eiwitten (BMPs) lokaal geremd tijdens de inductie van neurale kam afgeleide been 4, 15, of de ontwikkeling van ledematen knop 13. Na een kraal is geïmplanteerd, kan het embryo worden teruggebracht naar de incubator en zal blijven ontwikkelen. Hierdoor onderzoekers de stroomafwaartse effecten van de remming van een bepaald gen (in dit geval BMP), te bekijken, zoals de remming van sclerale beentje formatie in de sclerotische ring (figuur 2B en 2C) 15. Evenzo kunnen barrières gemakkelijk ingevoegd tussen weefsellagen om weefsel aan weefsel signalering en de micro-injectie van kleurstoffen kan ook gemakkelijk worden uitgevoerd bestuderen. 
Figuur 1. Het bekijken van de embryo ex ovo. (A) HH stadium 20 kippenembryo na verwijdering uit de schelp, pijl wijst naar het embryo met gevasculariseerd embryonale membranen. (B) A HH stadium 40 embryo in een open vochtkamer. (C) HH stadium 35 embryo waaruit vroege ledematen (pijl). (D) Stage HH 41 embryo waaruit later ontwikkelingsstadium van structuren zoals het oog (pijl). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Voorbeeld van Noggin geweekt kraal Implantatie experiment. 4 (A) Embryo HH stadium 35 belicht door een klein gat in de liggende membranen om toegang tot de onderliggende oog voor kralen implantatie krijgen. Hoge vergroting van de Affigel kraal naast een conjunctivale papilla wordt getoond in inzet. Schaal bar in C is 75 micrometer. (B) Alkaline fosfatase gekleurd rechteroog na Noggin kraal implantatie (pijl) toont gat in de ring van de gehoorbeentjes, HH 38 (C) AP gekleurd linkeroog toont geen verstoring van de ring van de gehoorbeentjes (controle ), HH 38. Details van dit experiment worden gegeven in Duench en Franz-Odendaal 4. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex ovo kweken en vensteropdrachten beide hebben voordelen en uitdagingen. Hier vergelijken we de voordelen en uitdagingen van het plastic bekertje ex ovo-methode en de window-methode om onze geoptimaliseerde ex ovo methode hier getoond. Met onze methode kunnen manipulatie en gemakkelijke observatie van het kippenembryo in de late stadia van de ontwikkeling en onze verfijningen aan de traditionele ex ovo methode 1, 2, 3 maken het bovendien zeer makkelijk te gebruiken in undergraduate onderwijs laboratorium klassen.
Hoewel veel onderzoekers de voorkeur aan de window-methode om kip ontwikkeling te bestuderen, want het is eenvoudig uit te voeren en heeft uitstekende overlevingskansen te late stadia van ontwikkeling (HH 41-42), het heeft beperkingen. Het grootste is de beperkte mogelijkheid om het gehele embryo na HH stadium 30. bekijken Na stadium HH 30, het raam in de eierschaal moet zeer groot zijn om de toenemende, bewegende embryo zien zijn. Deze grote raam is difficult te verzegelen volledig (wat leidt tot problemen met de steriliteit en de overlevingskansen), en het verkrijgen van een goede verlichting in het ei kan een uitdaging zijn. Bovendien gevorderd embryo's groot en moeilijk toegankelijk (of manipuleren) door het raam.
De ex ovo hier beschreven methode biedt volledige ongeremd toegang tot het embryo. Zodra de wegen boot wordt geplaatst in de vochtige kamer, de hele set-up is zeer stabiel. De gehele vochtige kamer kan onder een dissectie microscoop geplaatst en hoge vergroting kan worden gebruikt om de gehele embryo observeren. In vergelijking, de plastic bekertje werkwijze een vochtige kamer die hoog (cuphoogte) en dit maakt het moeilijk voor onder de microscoop doelstellingen. De kop ontwerp is ook veel minder stabiel dan de vlakke wegen boot en deze bekers kunnen eenvoudig worden omgestoten. Onze verbeteringen aan de ex ovo-methode maakt deze methode eenvoudig te gebruiken in een klaslokaal of lab-instelling en maakt het student om volledige toegang tot embryo's van het podium HH 19 tot en met HH 40 hebben; ensceneert wanneer belangrijke organogenese optreedt. Het grootste nadeel van onze ex ovo methode is steriliteit. Om infectie te voorkomen, onze werkwijze de toevoeging van antibiotica. Een dosering van antibiotica kan worden gegeven aan het embryo in latere stadia. De toegediend tijdens cultuur set-up antibiotica lijkt ook niet te beïnvloeden ontwikkeling van het embryo. Steriliseren containers met 70% ethanol voor gebruik drastisch vergroot overlevingskansen.
Over het algemeen, de ex ovo methode is ideaal voor het bekijken en manipuleren van embryo's zonder beperkingen op de toegang of ontwikkelingsstadium. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat het kweken van de embryo's ex ovo heeft geen negatieve invloed op de patroonvorming van 4,15. Zo doen we geen veranderingen in de patronen of inductie van het skelet te zien, ondanks de afwezigheid van de eierschaal. Onze verbeterde methode lost meerdere cUITDAGINGEN die er zijn met de huidige traditionele ex ovo methode 1,2, 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen met betrekking tot de informatie die in dit manuscript informatie.
Acknowledgments
We willen graag Paul Poirier, de Media Producer, bij Mount Saint Vincent University bedanken voor zijn werk in het filmen en bewerken van de video deel van dit manuscript. Wij erkennen de Natural Science and Engineering Research Council van Canada voor financiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
- Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
- Dorrell, M. I., et al. Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development. American Biology Teacher. 74 (9), (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88, 49-92 (1951).
- Drossopoulou, G., et al. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling. Development. , 127-1337 (2000).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Franz-Odendaal, T. Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus. Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).
