细菌表面电位测量用开尔文探针力显微镜

Summary

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Abstract

表面电位是起着微生物到基材表面的密合性的主导作用，一个经常被忽视的物理特性。开尔文探针力显微镜（KPFM）是原子力显微镜（AFM）的模块，其测量在纳米尺度表面之间的接触电势差。 KPFM的通过AFM的组合允许同时产生表面电位和生物标本的地形图，如细菌细胞。在这里，我们采用KPFM检查表面电位对微生物的粘附性医学相关的表面的效果，如不锈钢和金。表面电位的地图显示在不同的材料基板微生物膜在表面电位差。的工序高度图形生成显示在表面电位差在衬底表面和微生物之间的边界区域。变化在细胞膜表面电位已经与变化S IN细胞代谢和蠕动。因此，KPFM表示可被用来考察微生物膜表面电位在粘结到各种基底的表面的变化的有力工具。在这项研究中，我们展示的过程来描述个人的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 USA100细胞的表面电位使用KPFM不锈钢和黄金。

Introduction

对生产设备表面和皮肤伤口生物膜存在一个问题，医疗行业作为生物膜是顽抗移走，并可能导致疾病传播和抗菌药物耐药率增加。附件是在生物膜形成的第一步，是由于它的可逆性^1-3中最关键的步骤。基材表面特性发挥的微生物附着了至关重要的作用。因素，如表面硬度，孔隙度，表面粗糙度，和疏水性已被证明以进行微生物附着;然而，一些研究考察的基材表面电位（SP）对微生物粘附的作用已经做了^4,5。带负电荷的表面防止苏云金芽孢杆菌的孢子附着到云母，硅和金^6。变化细胞膜电位是指示改变的细胞附着和蠕动^5,7的。已经观察到，电坎ogeneous表面更容易促进微生物黏附^5。表征细菌的表面电位在纳米可以提供一种新的方式来理解细菌附着动力学到各种表面，从而可以在防生物结垢策略的发展提供帮助。不像用于表征细菌，如电泳光散射，ζ电位和等电点测定的电动力学的其他方法，开尔文探针力显微镜（KPFM）允许单个细胞而不是整个培养^8-11的检查。想要以比较细胞 – 细胞或生物膜电特性与高准确度和精度时，这是有利的。

KPFM是原子力显微镜（AFM）的模块。 AFM是作为扫描隧道显微镜^（STM）12的直接结果。利用STM首次公布的图像是由格尔德Binnig和海因里希Rorhrer于1982年¹²完成</suP>。其发明是能够解决的原子结构由光栅扫描一个尖锐导电尖端上的导电表面中的空气。实现激发生物学家谁很快企图使用STM对DNA，蛋白质的图像干燥的样品，和病毒¹²高分辨率图像的含义。 STM也可以使用专门的探针针尖¹³的液体进行。这显示出由Lindsay 等 ，谁使用STM和AFM图像的DNA分子在10mM的HClO ₄和水，在金电极^13。 KPFM已被证明在确定的DNA和蛋白质分析²⁵和生物分子与配体相互作用²⁶的表面电位。

KPFM操作，通过测量的AFM导电悬臂刀片和一个理想的导电性样品之间的接触电势差（CPD）（ 图^{1，I）14,15。}样品不一定必须是导电的（ 即，生物SAMPLES）。成像可以进行对云母，玻璃和硅表面（非导电），只要该非导电表面是薄且有一个基本的导电材料^6,7。在CPD相当于表面电位的电压，并且可以被描述为在尖端（φ _尖 ）和样品（φ _样品 ）之间的功函数的差，通过负电子电荷除以（ – E）。当导电针尖被带到靠近一个样品表面由于在费米能量的差（ 图1，二，一 ^）15（由距离 d分开），静电力（F _ES）被产生。在这一点上，针尖和样品（E _v）的的真空能量处于平衡和对准。在使前端接近样品表面时，尖端与样品表面接触到电接触，并作为平行平板电容器（ 图1，二B </strong>的^）14,15。在该点上，该尖端与样品表面的费米能量变得对准，达到稳态平衡（ 图1，二，二）。针尖与样品表面将收取和为 V _CPD将形成因于 E _V's和功函数的差。 A F _ES作用于电接触面积，由于形成V _CPD。这个力通过外部V _DC到具有相同大小的形成V _CPD前端应用程序随后无效（ 图1，二，三）。此DC电压施加消除表面电荷中的电接触的面积，并且V _DC必要消除第V _CPD在 F _ES的量等于所述差在SA之间的功函数mple面和小费^15。应当指出的是，尖的功函数是已知的，它是由制造商提供。在所有KPFM方法，AC电压（V _AC，大约100 – 500毫伏）也被施加到尖端，以便产生所述针尖和样品¹⁴之间振荡电力。这个测量的变化以V _CPD和/ 或 F _ES时提供更好的分辨率。在这点上，变化的频率或电振荡的振幅可通过V _DC被纠正，以及表面可以产生潜在的地图。从这些地图的特定区域的数据，可以进一步分析，以提供关于特定地形特征的电信息。

（1）提升模式，（2）调幅（AM）模式，及（3）的频率调制（FM）模式^14,16：KPFM可以在三种模式下操作。升降模式为初始增量arnation KPFM的。升降机模式依赖于在其中振荡尖端在表面拖动以获得地形图像的两遍方法。用于第二遍的前端被升高的样品上方的预设距离（10 – 100 nm），而扫描背面横过相同的面积。由于此两遍方法，升降模式，相比AM-和FM KPFM，花费的时间最长为图像采集。提高尖端远离所述表面确保只有长范围 F _ES被测量。此外，地形和表面电位测量之间的串扰被解耦在增加横向分辨率和灵敏度为代价的。

AM-KPFM提高通过使用双频率同时测量样品形貌和表面电位（单程扫描^）14横向分辨率和灵敏度。在AM模式，悬臂机械振荡，一般为5％，低于它的第一谐振频率（f _0），并且电振荡（叔hrough一个V _AC）在其第二谐振频率（f _1）。变化的f _0的引线的振幅地形数据的生成，而变化f中₁的幅度时，由于改变在F中_ES和 V _CPD，得到表面电位的测量数据。 f ₀的和f悬臂₁通过显著频率和能量为信号串扰最小化¹⁴是分开的。原子力显微镜头电子箱（HEB）分离出两个信号给这两个地形和一次扫描同时表面电位的数据。 FM-KPFM提高对生物表面¹⁴的分辨率甚至比AM-KPFM。 FM-KPFM作品不同于AM-KPFM，它衡量的变化静电力梯度，而不是静电力（F _^ES）15。像AM模式，FM模式利用双频率和SINGLe通扫描机制获取地形，同时表面电位数据^14。在FM模式中，悬臂机械振动在f ₀和在低的改进的频率振荡电（F _模 ，典型的是1 – 5千赫）。经静电相互作用，女₀和f _MOD叠加可产生边带f ₀的±˚F _国防部 。这些边带是变化的静电力非常敏感，并且可以从f ₀的通过AFM的HEB分离。既然调频KPFM测量变化的静电力梯度，尖端顶点的形状和它的维护/完整性发挥整体表面电位分辨率^14,15关键的作用。采用调幅表面电位分辨率和FM模式中的1纳米的范围内横向^{14 -16。}应当指出的是KPFM成像能够在非极性液体中来实现，并且更近来，已经显示出在低离子（<10毫米）极性液体进行（在开环KPFM模式不需要一个偏压反馈，从而消除的DC偏置的应用），例如milliQ水中;然而，KPFM成像尚待于活细胞中的极性溶液^17-20进行。带SP显像液相关的额外的挑战是，解决方案通常用于维持细胞（ 即，磷酸盐缓冲盐水）具有高浓度的移动离子，这将导致法拉第反应，偏置感应电荷动力学，和离子扩散/再分配^20。因此，对于这个实验中，测量是从干燥的和死的MRSA细胞上在环境条件下聚 – L – 赖氨酸官能不锈钢和金表面。成像可以在空气中进行或真空条件上是先前已经干燥或固定到表面²⁰的生物样品。潮湿的条件下也被证明影响表面⁶的KPFM成像。

在这项研究中，我们采用FM-KPFM和AFM研究SP对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 USA100（MRSA）到聚-L-赖氨酸官能不锈钢和金表面的附着的作用。 MRSA最近获取了状态作为一个多药耐药（MDR）“超级病菌”，因为它的许多β内酰胺类抗生素和头孢菌素类²¹自然选择的阻力。 MRSA感染现在更加具有挑战性的，困难的，强大的治疗，导致使用更苛刻的抗菌剂，如万古霉素或具有在人类毒性较高的水平，因此不能被用作长期治疗²²恶唑烷酮。不锈钢被选择，因为它的医疗相关性和作为金用作对比金属中的皮下注射针头，便盆，门把手，水槽等的材料共同使用。 FM-KPFM被用来研究是否微生物膜的SP时附着改变为衬底。

Protocol

1.准备玻璃器皿和文化在继续进行这个实验，准备5％绵羊血琼脂（SBA）板种植MRSA。孵育SBA板放置24小时，在37℃。此时间之后，单一的，良好的分离的菌落应存在以用于后续接种到液体介质中。商店划线SBA板的单菌落，在4℃下进行1 – 2个月。 注：羊的血琼脂平板进来20之间含有预先制备的包装 – 根据制造商25板，并通常由用加入了5％w / v的羊的血液中的胰蛋白酶大豆琼脂基。 ?…

Representative Results

以测量的SP使用KPFM的能力依赖于原理，这两个样品表面和悬臂刀片是导电的，以某种程度。不锈钢和黄金采取行动，而MRSA被装导电表面。 KPFM拍摄图像15的MRSA细胞的两个表面上具有512×512的分辨率，并与扫描区域范围从5×5微米至10×10微米。扫描，进行与线速度范围为0.02行/秒至0.05行/秒。因此，有512个数据点每行512线扫描采集，扫描时间范围为2.84小时至7.11小时。采集到的图像的种类可以看出，在<…

Discussion

KPFM被用作一种新的技术，用于获得表面电数据。它通常被用作研究化学电荷分布的方法和最近才开始被应用于对微观和纳米尺度的生物系统的研究。从收集到的数据，我们发现，微生物并未以容易地连接到清洗不锈钢和金表面，即使经过3小时的静态培养。聚-L-赖氨酸的官能表面呈30分钟后快速微生物附着。在功能化表面微生物的潜伏期较长时间导致电池过分拥挤样品表面，差的地形图像。表面?…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
5500ILM Atomic Force Microscope	Agilent Technologies	#N9435S
AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16219	Stainless steel sample discs
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	There are 4 Pt-coated cantilevers per chip.  We utilized cantilever B for experiments.
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16218-G	Gold sample discs
PicoView Software	Agilent Technologies	#N9797B	5500ILM Atomic Force Microscope imaging software
Pico Image Software (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge	Thomas Scientific	#91201513	Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BD	#221261	Pre-made plates
Tryptic Soy Broth	BD	#257107	Comes as a dry powder.  Instruction on how to make come on the container.