سطح القياس المحتمل للبكتيريا عن طريق كلفن التحقيق قوة المجهر
Summary
Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.
Abstract
إمكانات سطح هي الخصائص الجسدية يغفل عادة أن يلعب دورا مهيمنا في التصاق الميكروبات إلى الركيزة الأسطح. كلفن القوة التحقيق المجهري (KPFM) هو وحدة من مجهر القوة الذرية (AFM) الذي يقيس فرق الجهد الاتصال بين السطوح في مقياس النانو. مزيج من KPFM مع AFM يسمح للجيل في وقت واحد من إمكانات السطحية والخرائط الطوبوغرافية من العينات البيولوجية مثل الخلايا البكتيرية. هنا، ونحن توظيف KPFM لدراسة الآثار المحتملة على سطح التصاق الميكروبات على الأسطح ذات الصلة طبيا مثل الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب. كشفت سطح خرائط المحتملة الاختلافات في إمكانية السطح لالأغشية الميكروبية على ركائز مواد مختلفة. تم إنشاء رسم بياني خطوة الارتفاع لإظهار الفرق في الإمكانيات السطح في منطقة الحدود بين سطح الركيزة والكائنات الحية الدقيقة. وقد تم ربط التغيرات في الخلوية إمكانات سطح الغشاء مع التغييرالصورة في الأيض الخلوي والحركة. ولذلك، KPFM يمثل أداة قوية التي يمكن استخدامها لدراسة التغيرات في الميكروبية إمكانات سطح الغشاء على الانضمام إلى السطوح المختلفة الركيزة. في هذه الدراسة، ونحن لشرح إجراءات لتوصيف إمكانات سطح الخلايا الفردية المقاومة للميثيسيلين المكورات العنقودية الذهبية USA100 على الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب باستخدام KPFM.
Introduction
الأغشية الحيوية المنتجة على أسطح المعدات والجروح الجلدية تمثل مشكلة للصناعة الطبية والأغشية الحيوية هي المتمردة لإزالة ويمكن أن تؤدي إلى زيادة معدلات انتقال المرض ومقاومة مضادات الميكروبات. المرفق هو الخطوة الأولى في تشكيل بيوفيلم وهي الخطوة الأكثر أهمية بسبب عكس لها 1-3. خصائص سطح الركيزة تلعب دورا حاسما في مرفق الميكروبي. وقد تبين أن عوامل مثل صلابة السطح، المسامية، خشونة، وللا مائية لإحداث مرفق الميكروبي. ومع ذلك، فقد تم القيام به القليل من البحث دراسة دور إمكانات سطح الركيزة (SP) على التصاق الميكروبات 4،5. الأسطح المشحونة سلبا منع المرفق من الجراثيم العصوية باسيلوس لالميكا، السيليكون، والذهب 6. تغيرات في غشاء المحتملة الخلوية هي تشير لتغييرات في مرفق الخلوي والحركة 5،7. وقد لوحظ أن هوم كهربائياالسطوح ogeneous تعزيز بسهولة أكبر الميكروبية التصاق 5. يمكن أن تميز إمكانات سطح البكتيريا على مقياس النانو توفير وسيلة جديدة لفهم حركية التصاق البكتيريا إلى مختلف الأسطح، وبالتالي يمكن أن تساعد في تطوير استراتيجيات مكافحة biofouling. وعلى عكس الطرق الأخرى المستخدمة لوصف حركية الكهربائية من البكتيريا، مثل تشتت الضوء الكهربي، وإمكانات زيتا، وتحديد نقطة تساوي الكهربائية، كلفن التحقيق قوة المجهر (KPFM) يسمح لفحص الخلايا الفردية بدلا من الثقافات كلها 8-11. وهذا مفيد عند الرغبة في مقارنة خلية خلية أو بيوفيلم الخصائص الكهربائية بدقة عالية ودقة.
KPFM هو وحدة من مجهر القوة الذرية (AFM). وقد وضعت AFM كنتيجة مباشرة للمجهر المسح النفقي (STM) 12. وقد أجريت هذه الصور نشرت لأول مرة باستخدام STM من قبل جيرد بينيج وهاينريش Rorhrer في عام 1982 12 </suP>. كان اختراعهم قادرة على حل هياكل ذرية بواسطة النقطية مسح طرف موصل حاد على سطح موصل في الهواء. الآثار المترتبة على تحقيق صور عالية الدقة متحمس علماء الأحياء الذين حاولوا بسرعة لاستخدام STM لعينات صورة المجففة من الحمض النووي والبروتينات، والفيروسات 12. ويمكن أيضا أن يتم STM في السوائل باستخدام نصائح التحقيق المتخصصة 13. وقد تبين ذلك من خلال ليندساي وآخرون، الذين استخدموا STM وAFM إلى صورة جزيئات الحمض النووي في 10 ملي HClO 4 و في الماء، على أقطاب الذهب 13. وقد تجلى KPFM في تحديد إمكانات سطح DNA والبروتين تحليل 25 والجزيئات الحيوية التفاعل مع بروابط 26.
KPFM تعمل عن طريق قياس اتصال فرق الجهد (CPD) بين AFM موصل طرف ناتئ وعينة موصل مثالي (الشكل 1، ط) 14،15. عينات لا يتعين بالضرورة أن يكون موصل (أي sampl البيولوجيالخانات). يمكن أن يتم التصوير بها على الميكا، والزجاج، والسطوح السيليكون (غير موصل) طالما سطح غير موصل رقيقة، وهناك مادة موصلة الكامنة 6،7. وثيقة البرنامج القطري ما يعادل سطح المحتملين الجهد ويمكن وصفها بأنها الفرق في وظائف العمل بين طرف (φ طرف) وعينة (عينة φ)، مقسوما على شحنة الإلكترون السالب (- ه). عندما يتم إحضارها تلميح AFM موصل على مقربة من سطح العينة (مفصولة المسافة د)، يتم إنشاء القوة الكهروستاتيكية (عناوين F) وذلك بسبب الفرق في الطاقات فيرمي (الشكل 1، والثاني، أ) 15. في هذه المرحلة، والطاقات فراغ من طرف وعينة (E ت) هي في حالة توازن والانحياز. على جلب غيض أقرب إلى سطح العينة، وغيض وعينة سطح تتلامس الكهربائية والتصرف كما المكثفات لوحة موازية (الشكل 1، والثاني، ب </stronز>) 14،15. في هذه النقطة، والطاقات فيرمي من طرف وعينة السطح تصبح الانحياز، التوصل إلى توازن الحالة المستقرة (الشكل 1، والثاني، ب). وستحمل سطح طرف وعينة وسوف تشكل CPD V بسبب وجود اختلاف في E ضد الصورة والعمل وظائف. A F فاق أفعال على منطقة الاتصال الكهربائية بسبب CPD V تشكيلها. وألغى هذه القوة في وقت لاحق من خلال تطبيق على DC V الخارجية إلى طرف له نفس الحجم مثل CPD V شكلت (الشكل 1، والثاني، ج). هذا تطبيق DC الجهد يلغي تهمة السطحية في مجال الاتصال الكهربائية، ومقدار V DC ضرورية للقضاء على وفاق F من V CPD يساوي الفرق في وظائف العمل بين ساmple السطحية وطرف 15. وتجدر الإشارة إلى أن وظيفة عمل من طرف معروفة وتقديمها من قبل الشركات المصنعة. في جميع وسائل KPFM، وهو الجهد AC (V AC، ما يقرب من 100-500 فولت) يتم تطبيق أيضا إلى طرف من أجل توليد القوى الكهربائية تتأرجح بين طرف والعينة 14. وهذا يوفر أفضل قرار عند قياس التغيرات في V CPD و / أو وفاق F. في هذا الصدد، والتغيرات في التردد أو السعة من التذبذب الكهربائية يمكن تصحيحها عن طريق V DC، وسطح يمكن إنشاء الخرائط المحتملة. بيانات من مناطق محددة من هذه الخرائط يمكن تحليلها لتوفير المعلومات حول الميزات الكهربائية الطبوغرافية محددة.
KPFM يمكن تشغيلها في ثلاثة أوضاع: (1) وضع المصعد، (2) تعديل السعة (AM) واسطة، و (3) تضمين التردد (FM) واسطة 14،16. كان وضع ارفع المؤتمر الوطني العراقي الأوليarnation من KPFM. يعتمد وضع رفع على طريقة بتمريرين التي يتم سحب تلميح تأرجحت عبر السطح للحصول على صورة الطبوغرافية. للمسار الثاني يتم رفع رأس مسافة محددة مسبقا فوق العينة (10-100 نانومتر) ومسحها العودة عبر نفس المنطقة. ونتيجة لهذا الأسلوب تمرير اثنين، ووضع المصعد، مقارنة صباحا و وFM-KPFM، ويأخذ وقتا أطول لاكتساب صورة. رفع طرف بعيدا عن سطح يضمن أن يتم قياس طويلة المدى فقط F وفاق. أيضا، يتم فصله عبر الحديث بين التضاريس والسطح قياسات المحتملة على حساب زيادة قرار الجانبي والحساسية.
AM-KPFM يحسن قرار الجانبي والحساسية باستخدام الترددات المزدوجة في وقت واحد لقياس تضاريس العينة وإمكانات السطحية (واحدة تمر مسح) 14. في AM النمط، تراوح ناتئ ميكانيكيا، عموما 5٪ أقل من الأول ترددها الرنانة (و 0)، وتأرجحت كهربائيا (رhrough لV AC) في ترددها الثاني الرنانة (و 1). التغيرات في اتساع و 0 تؤدي إلى توليد البيانات الطبوغرافية، في حين أن التغيرات في اتساع و 1، نتيجة للتغيرات في وفاق F وV CPD، وإعطاء بيانات القياس المحتملة السطح. و 0 و 1 و للناتئ تكون مفصولة الترددات والطاقات الكبيرة التي تشير إلى أدنى حد ممكن عبر الحديث 14. مربع الالكترونيات رئيس (عب) من AFM يفصل من الإشارات اثنين لإعطاء كلا الطوبوغرافية والسطحية البيانات المحتملة في وقت واحد في مسح واحد. FM-KPFM يحسن قرار أبعد من AM-KPFM على الأسطح البيولوجية 14. FM-KPFM يعمل بشكل مختلف عن AM-KPFM في أنه يقيس التغيرات في التدرجات القوة الكهروستاتيكية بدلا من القوة الكهروستاتيكية (عناوين F) 15. مثل AM اسطة، ووضع FM يستخدم الترددات المزدوجة وسينغلتمريرة الإلكترونية آلية المسح الضوئي للحصول على الطبوغرافية والسطحية البيانات المحتملة في وقت واحد 14. في وضع FM، وتأرجحت ناتئ ميكانيكيا في f 0 وتأرجحت كهربائيا في التردد المنخفض المعدلة (و وزارة الدفاع، وعادة 1-5 كيلو هرتز). على التفاعلات كهرباء، و 0 و F مزيج زارة الدفاع لإنتاج أشرطة جانبية و و 0 ± وزارة الدفاع. هذه sidebands حساسة جدا للتغيرات في القوة الكهروستاتيكية، ويمكن فصلها عن و 0 إلى HEB على AFM ل. منذ FM-KPFM يقيس التغيرات في التدرجات القوة الكهروستاتيكية، نصائح على شكل ذروتها ولها صيانة / سلامة تلعب دورا حاسما في السطح الكلي قرار محتمل 14 و 15. السطحية قرار محتمل باستخدام AM وسائط FM هي في حدود 1 نانومتر أفقيا 14 -16. وتجدر الإشارة إلى أن KPFM التصوير يمكن القيام به في السوائل غير القطبية، وأكثر من ذلك في الآونة الأخيرة، وقد تبين مما ينبغي عمله في (<10 ملم) السوائل القطبية منخفضة الأيونية (فيوسائط KPFM حلقة مفتوحة والتي لا تتطلب ردود الفعل التحيز، مما يغني عن تطبيق التحيز DC) مثل المياه MilliQ. ومع ذلك، لم يتم بعد القيام KPFM التصوير على الخلايا الحية في حلول القطبية 17-20. التحديات الإضافية المرتبطة التصوير SP في السائل هو أن الحلول التي تستخدم عادة للخلايا الحفاظ على (أي الفوسفات مخزنة المالحة) لديها تركيزات عالية من الأيونات النقالة، والتي من شأنها أن تؤدي إلى ردود فعل Faradaic، وديناميات تهمة الناجم عن التحيز، والأيونات نشر / إعادة توزيع 20. وهكذا، على هذه التجربة، وقد أخذت مقاييس من خلايا MRSA المجففة والميتة على أسطح بين functionalized الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب بولي-L-يسين في ظل الظروف المحيطة. يمكن أن يتم التصوير في ظروف الهواء أو الفراغ على العينات البيولوجية التي تم سابقا المجففة أو يجمد على السطوح 20. وقد تبين أيضا أن تؤثر الظروف الرطبة التصوير KPFM الأسطح 6.
في هذه الدراسة، قمنا بتوظيف FM-KPFMوAFM إلى دراسة دور SP على المرفق المقاومة للميثيسيلين المكورات العنقودية الذهبية USA100 (MRSA) إلى السطوح بين functionalized بولي-L-يسين الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب. هذه الجرثومة قد اثار مؤخرا وضعية متعددة والمقاومة للعقاقير (MDR) "بكتيريا" بسبب مقاومته اختيار طبيعي لكثير من المضادات الحيوية β لاكتام والسيفالوسبورين 21. التهابات MRSA هي الآن أكثر تحديا، صعبة، وهائلة لعلاج، مما أدى إلى استخدام مضادات الميكروبات أقسى مثل فانكومايسين أو oxazolidinones التي لديها مستويات سمية أعلى في البشر، وبالتالي لا يمكن استخدامها في العلاجات طويلة الأجل 22. وقد تم اختيار الفولاذ المقاوم للصدأ نظرا لأهميتها الطبية والاستخدام المشترك كمادة في إبر الحقن، مدفئة السرير، مقابض الأبواب، والمصارف، وما إلى ذلك كان يستخدم الذهب كمعدن المقارن. استخدمت FM-KPFM لفحص إذا تغير الميكروبية غشاء SP على التعلق ركائز.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان يعمل KPFM كتقنية جديدة للحصول على بيانات الكهربائية السطح. وعادة قد تستخدم كوسيلة من وسائل لدراسة توزيع تهمة في الكيمياء وبدأت مؤخرا فقط ليتم تطبيقها لدراسة النظم البيولوجية على المتناهية الصغر والمقاييس نانو. من البيانات التي تم جمعها وجدنا أن الميكروبات لا يبدو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors sincerely thank the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, the Ontario Ministry of Research and Innovation, and the Canada Foundation for Innovation for funding this study.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
References
- Seth, A. K., et al. In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review. J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).
- Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. Biofilms and chronic infections. JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).
- Hoiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).
- Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells. Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).
- Lorite, G. S., et al. Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development. PLoS One. 8 (9), (2013).
- Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces. Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).
- Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon. J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).
- Soon, R. L., et al. Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment. J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).
- Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).
- Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells. Ann Microbiol. , (2013).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).
- Lindsay, S. M., et al. Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface. J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).
- Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode. Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).
- Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. probe force microscopy and its application. Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).
- Loppacher, C., et al. FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking. Nanotechnology. 16 (3), (2005).
- Domanski, A. L., et al. Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids. Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).
- Collins, L., et al. Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface. Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103 (2014).
- Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy. Rev. Sci. Instru. 81, (2010).
- Collins, L., et al. Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy. Nature Comm. 5, 2871 (2014).
- Pastar, I., et al. Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Brien, D. J., Gould, I. M. Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections. Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).
- Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and. 155 (2), 808-820 (2011).
- Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).
- Sinensky, A. M., Belcher, A. M. Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy. Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).
- Park, J., et al. Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy. ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).
