Surface de mesure potentielle de bactéries utilisant Kelvin Probe Force Microscopy

Summary

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Abstract

potentiel de surface est une caractéristique physique souvent négligé qui joue un rôle dominant dans l'adhérence des micro-organismes à des surfaces de substrat. Kelvin microscopie à force de sonde (KPFM) est un module de microscopie à force atomique (AFM) qui permet de mesurer la différence de potentiel de contact entre les surfaces à l'échelle nanométrique. La combinaison de KPFM avec AFM permet la génération simultanée de potentiel de surface et des cartes topographiques d'échantillons biologiques telles que des cellules bactériennes. Ici, nous employons KPFM pour examiner les effets de potentiel de surface sur l'adhésion microbienne des surfaces médicalement pertinents, tels que l'acier inoxydable et or. Surface cartes potentiels ont révélé des différences de potentiel de surface pour les membranes microbiennes sur des substrats différents matériels. Un graphe étape hauteur a été généré pour montrer la différence de potentiel de surface à une zone frontière entre la surface du substrat et des micro-organismes. Les variations de potentiel de surface de la membrane cellulaire ont été liés au changements dans le métabolisme cellulaire et la motilité. Par conséquent, KPFM représente un outil puissant qui peut être utilisé pour examiner les changements de potentiel de surface de la membrane microbienne sur l'adhérence à diverses surfaces de substrat. Dans cette étude, nous démontrons la procédure pour caractériser le potentiel de surface des cellules individuelles de Staphylococcus aureus résistant à la méticilline USA100 sur l'acier inoxydable et l'or en utilisant KPFM.

Introduction

Les biofilms produites sur les surfaces de l'équipement et dans les plaies cutanées présentent un problème pour l'industrie médicale que les biofilms sont récalcitrantes à l'enlèvement et peuvent conduire à une augmentation des taux de transmission de la maladie et de la résistance aux antimicrobiens. L'attachement est la première étape dans la formation de biofilm et est l'étape la plus critique en raison de sa réversibilité ^3.1. caractéristiques de la surface du substrat jouent un rôle crucial sur l'attachement microbienne. On a montré que des facteurs tels que la dureté de surface, porosité, rugosité, et pour effectuer la fixation hydrophobicité microbienne; Cependant, peu d'études sur le rôle de potentiel de surface de substrat (SP) sur l'adhérence microbienne a été fait ^4,5. Les surfaces chargées négativement empêcher la fixation de spores de Bacillus thuringiensis à mica, du silicium, de l'or et ^6. Les changements dans le potentiel de membrane cellulaire indiquent des changements dans l'attachement et la motilité cellulaire ^5,7. Il a été observé que hom électriquementsurfaces ogeneous plus facilement promouvoir microbienne adhérence ^5. Caractérisation du potentiel de surface des bactéries à l'échelle nanométrique peut fournir une nouvelle façon de comprendre la cinétique d'adhérence des bactéries à diverses surfaces, et peut ainsi aider à l'élaboration de stratégies anti-encrassement biologique. Contrairement à d'autres méthodes utilisées pour caractériser les cinétiques électro de bactéries, telles que la diffusion électrophorétique de lumière, le potentiel zêta, et isoélectrique détermination du point, Kelvin microscopie à force de la sonde (KPFM) permet l'examen de cellules individuelles au lieu de cultures entières ^8-11. Cela est bénéfique quand on veut comparer cellule-cellule ou biofilm caractéristiques électriques avec une grande précision et de précision.

KPFM est un module de microscopie à force atomique (AFM). AFM a été développé comme une conséquence directe de la microscope à effet tunnel (STM) ^12. Les premières images publiées en utilisant STM ont été faites par Gerd Binnig et Heinrich Rorhrer en 1982 ¹² </sup>. Leur invention a pu résoudre structures atomiques par balayage tramé une pointe conductrice forte sur une surface conductrice dans l'air. Les implications de la réalisation des images haute résolution des biologistes qui ont rapidement tenté d'utiliser STM images échantillons séchés de l'ADN, des protéines et des virus ¹² excité. STM peut aussi être fait dans les liquides à l'aide de pointes de sonde spécialisés ^13. Ceci a été démontré par Lindsay et al., Qui a utilisé STM et AFM de molécules d'ADN d'image dans HClO ₄ mM et 10 dans l'eau, sur des électrodes en or ^13. KPFM a été démontrée pour déterminer les potentiels de surface des ADN et des protéines et analyse des biomolécules ²⁵ interaction avec des ligands ^26.

KPFM fonctionne en mesurant la différence de potentiel de contact (CPD) entre une pointe d'AFM cantilever conducteur et un échantillon idéalement conductrice (Figure 1, i) ^14,15. Les échantillons ne doivent pas nécessairement être conducteur (ce est-sampl biologiques). L'imagerie peut être effectuée sur le mica, le verre, et des surfaces de silicium (non conductrices) aussi longtemps que la surface non-conductrice est mince et il ya une matière conductrice sous-jacente ^6,7. Le DPC est équivalente à la tension potentiel de surface et peut être décrit comme la différence dans les fonctions de travail entre la pointe _(pointe de φ) et l'échantillon _{(échantillon} de φ), divisé par la charge de l'électron négatif (- e). Quand une pointe AFM conducteur est amené à proximité d'une surface de l'échantillon (séparés par la distance d), une force électrostatique (F _ES) est généré en raison de la différence des énergies de Fermi (figure 1, II, a) ^15. À ce stade, les énergies à vide de la pointe et l'échantillon (E _v) sont en équilibre et alignés. Sur la pointe apportant plus près de la surface de l'échantillon, la surface de la pointe et l'échantillon entrent en contact électrique et d'agir comme des condensateurs de plaques parallèles (Figure 1, ii, b </strong>) ^14,15. Au point, les énergies de Fermi de la surface de la pointe et l'échantillon se alignent, atteignant un équilibre stationnaire (Figure 1, ii, b). La surface de la pointe et l'échantillon sera prélevé et un _DPC de V se former à cause d'une différence de E fonctions de _v et de travail. Un actes F _es sur la zone de contact électrique en raison de la _CPD formé de V. Cette force est ensuite annulé par l'application d'un _{courant continu} V externe à l'extrémité qui a la même grandeur que le _CPD formé de V (figure 1, ii, c). Cette tension appliquée DC élimine charge de surface dans la zone de contact électrique, et la quantité de V _DC nécessaire pour éliminer les _es F de V _CPD est égal à la différence dans les fonctions de travail entre le SAsurface de mple les pourboires ^15. Il convient de noter que la fonction de travail de la pointe est connu et il est fourni par les fabricants. Dans toutes les méthodes de KPFM, une tension alternative (V _AC, environ 100 à 500 mV) est également appliqué à la pointe afin de générer des forces électriques oscillants entre la pointe et l'échantillon ^14. Cette offre une meilleure résolution lors de la mesure des changements dans V _CPD et / ou F _es. À cet égard, les changements dans la fréquence ou l'amplitude de l'oscillation électrique peuvent être corrigées par V _DC, et la surface cartes de potentiel peuvent être générés. Les données provenant des domaines spécifiques de ces cartes peuvent être analysés plus de fournir des informations sur les caractéristiques topographiques électriques spécifiques.

KPFM peut fonctionner en trois modes: (1) Mode de levage, (2) le mode de modulation d'amplitude (AM), et (3) la modulation de fréquence (FM) en mode ^14,16. mode Ascenseur était la première incarnation de KPFM. Ascenseur mode se appuie sur une méthode en deux passes dans lequel une pointe oscille est traîné à travers la surface pour obtenir une image topographique. Pour la deuxième passe de la pointe est soulevé une distance préréglée dessus de l'échantillon (de 10 à 100 nm) et numérisé en arrière à travers la même zone. En raison de ce procédé en deux passes, en mode de levage, et par rapport à AM- FM-KPFM, prend le plus long temps d'acquisition d'images. Augmenter la pointe loin de la surface assure que seul longue portée F _es est mesurée. En outre, la diaphonie entre la topographie de surface et des mesures de potentiel est découplée au détriment de la résolution latérale et une sensibilité accrues.

AM-KPFM améliore la résolution et la sensibilité latérale en utilisant deux fréquences pour mesurer simultanément la topographie de l'échantillon et le potentiel de surface (de balayage en un seul passage) ^14. Dans le mode AM, le cantilever est mécaniquement oscille, généralement 5% en dessous de la première fréquence de résonance (f _0), et oscille électriquement (trâce un _AC V) à sa deuxième fréquence de résonance (f _1). Changements dans l'amplitude de f ₀ conduisent à la production de données topographiques, tandis que les changements dans l'amplitude de f _1, en ​​raison de changements dans _es F et V _CPD, donnent données de mesure potentiels de surface. f ₀ et f ₁ du cantilever sont séparés par des fréquences importantes et les énergies qui signalent diaphonie est réduite au minimum ^14. Le boîtier électronique de la tête (HEB) de l'AFM sépare les deux signaux pour donner à la fois topographique et données de surface potentiels simultanément dans une analyse. FM-KPFM améliore la résolution encore plus loin que AM-KPFM sur des surfaces biologiques ^14. FM-KPFM fonctionne différemment que AM-KPFM en ce qu'elle mesure les changements dans les gradients de force électrostatiques plutôt que force électrostatique (F _ES) ^15. Comme mode AM, le mode FM utilise deux fréquences et un singlmécanisme de balayage e-passe d'obtenir des données topographiques et la surface potentiels simultanément ^14. En mode FM, le cantilever est mécaniquement oscillait à f ₀ et oscillait électriquement à une basse fréquence modifiée (f _mod, généralement 1-5 kHz). Sur interactions électrostatiques, f ₀ et f _mod mix pour produire des bandes latérales f ₀ ± f _mod. Ces bandes latérales sont très sensibles aux variations de la force électrostatique, et peuvent être séparées de f ₀ par l'intermédiaire du HEB de l'AFM. Depuis FM-KPFM mesure les changements dans les gradients de force électrostatiques, la forme sommet de conseils et de son entretien / l'intégrité jouent un rôle critique dans l'ensemble surface de résolution potentielle ^{14, 15.} Surface résolution potentielle en utilisant les modes AM et FM sont de l'ordre de 1 nm latéralement ^{14 -16.} Il convient de noter que l'imagerie KPFM peut être fait dans les liquides non polaires, et plus récemment, a été montré à faire (<10 mm) des liquides polaires faiblement ionique (enKPFM modes en boucle ouverte qui ne nécessitent pas une rétroaction de polarisation, ce qui évite l'application d'une polarisation en courant continu), comme l'eau MilliQ; Toutefois, l'imagerie KPFM n'a pas encore été fait sur ​​des cellules vivantes dans des solutions polaires ^17-20. Défis supplémentaires associés à l'imagerie de SP dans un liquide est que les solutions couramment utilisés pour les cellules de maintien (ce est à dire, le tampon phosphate salin) ont des concentrations élevées d'ions mobiles, ce qui conduirait à des réactions de Faraday, la dynamique de la charge induite préjugés, et la diffusion d'ions / redistribution ^20. Ainsi, pour cette expérience, des mesures ont été prises à partir de cellules de SARM secs et morts sur acier inoxydable et or surfaces fonctionnalisés poly-L-lysine dans des conditions ambiantes. L'imagerie peut être effectuée dans des conditions atmosphériques ou sous vide sur des échantillons biologiques qui ont été préalablement séchés ou immobilisées sur des surfaces ^20. Conditions humides ont également été démontré que l'incidence imagerie KPFM des surfaces ^6.

Dans cette étude, nous avons utilisé FM-KPFMAFM et d'examiner le rôle de la SP sur la fixation du Staphylococcus aureus résistant à la méticilline USA100 (SARM) les surfaces en acier inoxydable et or fonctionnalisés poly-L-lysine. SARM a récemment valu le statut de multi-résistante (MDR) "superbactérie" en raison de sa résistance naturelle sélectionnée à de nombreux antibiotiques β-lactamines et les céphalosporines ^21. Les infections à SARM sont maintenant plus difficile, difficile, et formidable pour traiter, conduisant à l'utilisation des antimicrobiens plus sévères tels que la vancomycine ou oxazolidinones qui ont des niveaux plus élevés de toxicité chez l'homme, et donc ne peut pas être utilisé comme traitements à long terme ^22. L'acier inoxydable a été choisi en raison de sa pertinence médicale et l'utilisation commune comme matière dans les aiguilles hypodermiques, les bassines, les poignées de porte, des éviers, etc. L'or a été utilisé comme un métal comparative. FM-KPFM a été utilisé pour examiner si microbienne SP de la membrane change lors de la fixation des substrats.

Protocol

1. Préparation de la verrerie et des cultures Avant de procéder à cette expérience, préparer la gélose au sang de mouton à 5% (SBA) des plaques pour la culture SARM. Incuber les plaques SBA pendant 24 heures à 37 ° C. Après ce temps, simples, des colonies bien isolées doivent être présents à être utilisé pour des inoculations ultérieures dans des milieux liquides. Magasin strié plaques SBA avec des colonies isolées à 4 ° C pendant 1 à 2 mois. REMARQUE: Les plaques de gélose au sa…

Representative Results

La capacité de mesurer SP utilisant KPFM repose sur le principe que tant la surface de l'échantillon et la pointe de cantilever sont conducteurs dans une certaine mesure. Acier inoxydable et or ont agi comme des surfaces conductrices à laquelle SARM étaient attachés. KPFM images ont été prises de 15 cellules de SARM sur les deux faces avec 512 x 512 résolutions, et des zones de numérisation allant de 5 x 5 um à 10 um x 10. Balayage a été réalisé avec des vitesses de ligne allant de 0,02 lignes / s à 0…

Discussion

KPFM a été utilisé comme une nouvelle technique pour obtenir des données électriques de surface. Il a souvent été utilisé comme une méthode pour examiner la répartition de charge en chimie et n'a que récemment commencé à appliquer pour l'étude des systèmes biologiques sur le micro et nano-échelles. D'après les données recueillies nous avons constaté que les microbes ne semblent pas attacher facilement pour nettoyer les surfaces en acier inoxydable et or, même après 3 heures d'incubat…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
5500ILM Atomic Force Microscope	Agilent Technologies	#N9435S
AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16219	Stainless steel sample discs
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	There are 4 Pt-coated cantilevers per chip.  We utilized cantilever B for experiments.
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16218-G	Gold sample discs
PicoView Software	Agilent Technologies	#N9797B	5500ILM Atomic Force Microscope imaging software
Pico Image Software (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge	Thomas Scientific	#91201513	Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BD	#221261	Pre-made plates
Tryptic Soy Broth	BD	#257107	Comes as a dry powder.  Instruction on how to make come on the container.