משטח מדידת פוטנציאל של חיידקים באמצעות קלווין Probe מיקרוסקופית כוח
Summary
Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.
Abstract
פוטנציאל פני השטח הוא מאפיין פיזי נפוץ להתעלם שמשחק תפקיד דומיננטי בהידבקות של מיקרואורגניזמים למצע משטחים. מיקרוסקופיה קלווין כוח הבדיקה (KPFM) היא מודול של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) המודד את הפרש פוטנציאל קשר בין משטחים בקנה מידת ננו. השילוב של KPFM עם AFM מאפשר לדור בו זמני של פוטנציאל פני השטח ומפות טופוגרפיות של דגימות ביולוגיות כגון תאי חיידקים. כאן, אנו מעסיקים KPFM לבחון את ההשפעות של פוטנציאל פני השטח על הידבקות של חיידקים למשטחים רלוונטיים מבחינה רפואית כגון נירוסטה וזהב. מפות פוטנציאל פני השטח נמצאו הבדלים בפוטנציאל פני השטח לממברנות של חיידקים על מצעי חומר שונים. גרף צעד-גובה נוצר כדי להראות את ההבדל בפוטנציאל פני השטח באזור גבול בין פני המצע ומיקרואורגניזמים. שינויים בפוטנציאל פני השטח קרום תא נקשרו עם שינויים בחילוף חומרים ותנועתיות סלולריים. לכן, KPFM מייצג כלי רב עוצמה שיכול להיות מנוצל כדי לבחון את השינויים של פוטנציאל שטח קרום חיידקים על הידבקות למשטחי מצע שונים. במחקר זה, אנחנו מדגימים את ההליך כדי לאפיין את הפוטנציאל של תאי Staphylococcus aureus USA100 methicillin-עמיד בודדים משטח על נירוסטה וזהב באמצעות KPFM.
Introduction
Biofilms מיוצר על משטחי ציוד ובפצעי cutaneous מהווה בעיה עבור התעשייה הרפואית כbiofilms הוא סרבנים להסרת ויכול להוביל לעלייה בשיעור של העברת מחלות והתנגדות נגד חיידקים. קובץ מצורף הוא הצעד הראשון בהיווצרות biofilm והוא השלב הקריטי ביותר בשל ההפיכות שלה 1-3. מאפייני פני השטח מצע לשחק תפקיד מכריע בקובץ מצורף חיידקים. גורמים כגון קשיחות משטח, נקבוביות, חספוס, והידרופוביות הוכחו להשפיע קובץ מצורף חיידקים; עם זאת, מחקר קטן שבחן את תפקידו של פוטנציאל פני המצע (SP) על הידבקות של חיידקים נעשה 4,5. משטחים טעונים שלילי למנוע ההתקשרות של נבגי thuringiensis Bacillus ליציץ, סיליקון, וזהב 6. שינויים בפוטנציאל הממברנה סלולארי מעידים על שינויים בקובץ מצורף סלולארי ו5,7 תנועתיות. זה נצפה כי Hom חשמלימשטחי ogeneous יותר בקלות לקדם את ההידבקות של חיידקי 5. המאפיין את הפוטנציאל של חיידקי פני השטח בקנה המידה ננומטרי יכול לספק דרך רומן להבין קינטיקה ההידבקות של חיידקים למשטחים שונים, ובכך יכול לסייע בפיתוח אסטרטגיות אנטי-biofouling. בניגוד לשיטות אחרות המשמשות לאפיון קינטיקה אלקטרו של חיידקים, כגון פיזור electrophoretic אור, פוטנציאל זטה, ונחישות נקודת isoelectric, מיקרוסקופיה קלווין כוח הבדיקה (KPFM) מאפשרת הבדיקה של תאים בודדים במקום תרבויות שלמות 8-11. זה מועיל כאשר רוצה להשוות תאי תאים או biofilm מאפיינים חשמליים ברמת דיוק גבוהה ודיוק.
KPFM הוא מודול של מיקרוסקופיה כוח האטומית (AFM). AFM פותח כתוצאה ישירה של מיקרוסקופ מנהור הסורק (STM) 12. התמונות הראשונות שפורסמו באמצעות STM נעשו על ידי גרד ביניג והיינריך Rorhrer בשנת 1982 12 </sup>. ההמצאה שלהם הייתה מסוגלת לפתור מבנים אטומיים על ידי סריקה סריקת קצה מוליך חד מעל פני השטח מוליך באוויר. ההשלכות של השגת תמונות ברזולוציה גבוהה נרגשות ביולוגים שניסו במהירות כדי להשתמש STM לדגימות תמונה מיובשות של DNA, חלבונים, ווירוסים 12. יכול להיעשות גם STM בנוזלים באמצעות טיפים בדיקה מיוחדים 13. זה הוצג על ידי לינדזי et al., שהשתמש בSTM וAFM למולקולות DNA תמונה ב 10 מ"מ 4 HClO ובמים, על אלקטרודות זהב 13. KPFM הודגם בקביעת פוטנציאל Surface של ניתוח דנ"א וחלבון 25 ומולקולות ביולוגיות אינטראקציה עם ligands 26.
KPFM פועל על ידי מדידת הבדל המגע הפוטנציאלי (CPD) בין קצה AFM מוליך שלוחה ומדגם באופן אידיאלי מוליך (איור 1, i) 14,15. דוגמאות לא בהכרח חייבות להיות (כלומר, sampl ביולוגי מוליךes). הדמיה יכולה להתבצע על נציץ, זכוכית, וכל עוד המשטח שאינו מוליך הוא דק ויש חומר מוליך בסיסי 6,7 משטחי סיליקון (שאינם מוליכים). CPD הוא שווה ערך למתח פוטנציאל פני השטח וניתן לתאר את ההבדל בפונקציות העבודה בין הקצה (קצה φ) ומדגם (מדגם φ), מחולק בתשלום האלקטרונים השלילי (- ה). כאשר קצה AFM מוליך הוא הביא קרוב למשטח מדגם (מופרד על ידי מרחק d), כוח אלקטרוסטטי (es F) נוצר כתוצאה מההבדל באנרגיות פרמי (איור 1, ii,) 15. בשלב זה, את האנרגיות של הוואקום (v E) וקצה המדגם נמצאות בשיווי משקל ותואם. על הבאת הקצה קרוב יותר אל פני השטח המדגם, משטח הקצה והמדגם בא במגע חשמלי ולפעול כקבלים מקבילים צלחת (איור 1, ii, b </stronז>) 14,15. בנקודה, אנרגיות פרמי של פני השטח וקצה המדגם הופכות מיושרות, והגיעו לשיווי משקל מתמיד (איור 1, ii, ב). משטח הקצה ומדגם יחויב וCPD V יהווה בשל הבדל בפונקציות של v ועבודת E. מעשי es F באזור המגע החשמלי בשל CPD V נוצר. כוח זה בטל לאחר מכן באמצעות היישום של DC V חיצוני לקצה שיש את אותו גודל כמו CPD V נוצר (איור 1, ii, ג). זה מיושם מתח DC מבטל תשלום פני השטח באזור המגע חשמלי, והסכום של V DC הצורך לחסל את es F של CPD V הוא שווה להפרש בפונקציות העבודה בין saמשטח mple וקצה 15. יש לציין שפונקצית העבודה של הקצה ידועה והוא מסופק על ידי יצרנים. בכל שיטות KPFM, מתח AC (V AC, כ 100-500 mV) חל גם על הקצה על מנת ליצור כוחות חשמליים נעים בין הקצה והמדגם 14. זה מספק רזולוציה טובה יותר כאשר מודד שינויים בCPD V ו / או es F. בהקשר זה, שינויים בתדירות או משרעת תנודה חשמלית ניתן לתקן על ידי V DC, ועל פני השטח יכולות להיות שנוצרו מפות פוטנציאליות. נתונים מאזורים ספציפיים של מפות אלה ניתן לנתח נוספים על מנת לספק מידע על תכונות חשמליים טופוגרפיות ספציפיות.
יכול להיות מופעל KPFM בשלושה מצבים: (1) מצב מעלית, (2) מצב אפנון משרעת (AM), ו- (3) מצב 14,16 אפנון תדר (FM). מצב מעלית היה inc הראשוניarnation של KPFM. מצב Lift מסתמך על שיטת שתי עוקפת שבקצה נע נגרר על פני לקבל תמונה טופוגרפית. למעבר שני הקצה מורם מרחק קבוע מראש מעל המדגם (10 – 100 ננומטר) וסרק בחזרה אל מעבר לאותו אזור. בשל שיטה זו שתי עוקפת, מצב מעלית, בהשוואה לאמנון וFM-KPFM, לוקח את הזמן הארוך ביותר לרכישת תמונה. העלאת הקצה מהמשטח מבטיחה כי es F רק ארוך טווח נמדד. כמו כן, לדבר לחצות בין מדידות פוטנציאל טופוגרפיה ופני שטח decoupled על חשבון הרזולוציה רוחב מוגבר ורגישות.
AM-KPFM משפר רזולוציה רוחב ורגישות באמצעות דו-תדרים למדוד טופוגרפיה מדגם ופוטנציאל פני השטח (סריקה חד-פס) 14 בו-זמנית. במצב AM, השלוחה נעה מכאנית, בדרך כלל 5% מתחת לתדר התהודה הראשון שלה (ו 0), ונע חשמלי (through V AC) בתדר התהודה השני שלה (ו 1). שינויים במשרעת של f ליתרון 0 לדור של נתונים טופוגרפיים, ואילו שינויים במשרעת של f 1, כתוצאה משינויים בes F וCPD V, לתת נתוני מדידת פוטנציאל פני השטח. f 0 וf 1 של שלוחה מופרדים על ידי תדרים משמעותיים ואנרגיות שלאותת הצטלבות ממוזערת 14. האלקטרוניקה ראש התיבה (HEB) של AFM מפרידה את שני האותות לתת שני טופוגרפי ונתוני השטח פוטנציאליים בו-זמנית בסריקה אחת. FM-KPFM משפר רזולוציה עוד יותר מאשר AM-KPFM על משטחים ביולוגיים 14. FM-KPFM פועל בצורה שונה מאשר AM-KPFM בכך שהיא מודדת את השינויים בשיפועי כוח אלקטרוסטטי ולא בכוח אלקטרוסטטי (es F) 15. כמו מצב בבוקר, מצב FM מנצל כפולים תדרים וSinglמנגנון סריקת דואר לעבור כדי להשיג טופוגרפי ונתוני השטח פוטנציאליים בו זמנית 14. במצב FM, השלוחה נעה מכאנית בf 0 ונעה חשמלי בתדר שונה נמוך (ו mod, 1 בדרך כלל – 5 kHz). על אינטראקציות אלקטרוסטטיות, f 0 וf תערובת mod לייצר להקות צד f mod ו 0 ±. sidebands אלה רגישים מאוד לשינויים בכוח אלקטרוסטטי, ויכול להיות מופרד מf 0 דרך HEB של AFM. מאז FM-KPFM מודד שינויים בשיפועי כוח אלקטרוסטטי, צורת שיא הטיפים והתחזוקה / שלמותה לשחק תפקיד קריטי בשטח כולל רזולוציה פוטנציאל 14, 15. במשטח רזולוציה פוטנציאלית באמצעות AM ומצבי FM הם בטווח של 1 ננומטר רוחבי 14 -16. יש לציין כי ההדמיה KPFM ניתן לעשות זאת בנוזלים שאינם קוטביים, ולאחרונה, הוכח להיעשות ב( <10 מ"מ) נוזלי קוטב נמוכים יוניים (במצבים פתוח לולאה KPFM שאינו דורשים משוב הטיה, מייתר את היישום של הטיה DC) כגון מים MilliQ; עם זאת, ההדמיה KPFM טרם נעשתה על תאי חיים בפתרונות קוטביים 17-20. אתגרים נוספים הקשורים להדמית SP בנוזל הוא שפתרונות נפוצים לתאי שמירה (כלומר, שנאגרו מלוח פוספט) יש ריכוז גבוה של יונים ניידים, מה שיוביל לתגובות Faradaic, דינמיקת מטען נובע מהטיה, ודיפוזיה יון / חלוקה מחדש 20. כך, לניסוי זה, מדידות נלקחו מתאי MRSA מיובשים ומתים על משטחי poly-L ליזין פונקציונליות נירוסטה וזהב בתנאי סביבה. הדמיה יכולה להתבצע בתנאי אוויר או ואקום על דגימות ביולוגיות שכבר מיובש או משותקת על משטחים 20 בעבר. תנאי לחות גם הוכחו להשפיע הדמיה KPFM של משטחים 6.
במחקר זה, אנחנו עובדים FM-KPFMוAFM כדי לבחון את התפקיד של SP על הקובץ המצורף של methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) למשטחי נירוסטה וזהב פונקציונליות poly-L- ליזין. MRSA לאחרונה צבר מעמד רב-סמים (MDR) "superbug" עמיד בשל התנגדות טבעית שנבחרה לאנטיביוטיקה β-לקטם רב וcephalosporins 21. זיהומי MRSA הם עכשיו יותר מאתגר, קשים, ואימתניים לטיפול, שהובילו לשימוש באנטיביוטיקה חריפה יותר כגון vancomycin או oxazolidinones שיש רמות גבוהות יותר רעילות בבני אדם, ולכן אינו יכול לשמש כטיפול לטווח ארוך 22. נירוסטה נבחרה בשל הרלוונטיות רפואיות שלה ושימוש נפוץ כחומר במחטים תת עורי, סירי לילה, ידיות דלתות, כיורים, וכו 'הזהב שימש כמתכת השוואתית. FM-KPFM נוצל כדי לבחון אם SP קרום חיידקים משתנה על קובץ מצורף למצעים.
Protocol
Representative Results
Discussion
KPFM הועסק כטכניקה חדשנית לקבלת נתונים חשמליים פני השטח. זה בדרך כלל נעשה שימוש כאמצעי לבחינת חלוקת תשלום בכימיה וברק לאחרונה החל להיות מיושם לחקר מערכות ביולוגיות במייקרו וננו-מאזניים. מהנתונים שנאספו מצאנו כי חיידקים לא הופיעו לצרף בקלות לניקוי משטחי נירוסטה וזהב, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors sincerely thank the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, the Ontario Ministry of Research and Innovation, and the Canada Foundation for Innovation for funding this study.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
References
- Seth, A. K., et al. In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review. J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).
- Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. Biofilms and chronic infections. JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).
- Hoiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).
- Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells. Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).
- Lorite, G. S., et al. Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development. PLoS One. 8 (9), (2013).
- Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces. Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).
- Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon. J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).
- Soon, R. L., et al. Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment. J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).
- Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).
- Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells. Ann Microbiol. , (2013).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).
- Lindsay, S. M., et al. Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface. J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).
- Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode. Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).
- Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. probe force microscopy and its application. Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).
- Loppacher, C., et al. FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking. Nanotechnology. 16 (3), (2005).
- Domanski, A. L., et al. Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids. Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).
- Collins, L., et al. Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface. Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103 (2014).
- Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy. Rev. Sci. Instru. 81, (2010).
- Collins, L., et al. Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy. Nature Comm. 5, 2871 (2014).
- Pastar, I., et al. Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Brien, D. J., Gould, I. M. Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections. Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).
- Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and. 155 (2), 808-820 (2011).
- Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).
- Sinensky, A. M., Belcher, A. M. Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy. Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).
- Park, J., et al. Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy. ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).
