Overflaten Potential Måling av bakterier ved hjelp av Kelvin Probe Force Mikros

Summary

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Abstract

Overflatepotensialet er en ofte oversett fysisk karakteristikk som spiller en dominerende rolle ved adhesjon av mikroorganismer til substratoverflater. Kelvin probe force mikroskopi (KPFM) er en modul av atomic force mikroskopi (AFM) som måler kontakt potensialforskjell mellom flater på nano-skala. Kombinasjonen av KPFM med AFM muliggjør den samtidige generering av overflatepotensial og topografiske kart av biologiske prøver slik som bakterieceller. Her benytter vi KPFM å undersøke effekten av overflatepotensial på mikrobiell vedheft til medisinsk relevante overflater som rustfritt stål og gull. Overflate kart over mulige avdekket forskjeller i overflatepotensial for mikrobiell membraner på ulike materielle underlag. En trinnhøyde graf ble generert for å vise forskjellen i overflatepotensialet ved et grenseområde mellom substratets overflate og mikroorganismer. Endringer i cellemembranen overflatepotensialet har blitt koblet med endrings i cellenes stoffskifte og motilitet. Derfor KPFM representerer et kraftig verktøy som kan benyttes for å undersøke endringene av mikrobiell membranoverflaten potensial ved adhesjon til forskjellige substrat-overflater. I denne studie demonstrerer vi at fremgangsmåten for å karakterisere overflatepotensial av individuelle meticillin-resistente Staphylococcus aureus-celler USA100 på rustfritt stål og gull ved hjelp KPFM.

Introduction

Biofilm produsert på utstyrsoverflater og i kutane sår presentere et problem for den medisinske industrien som biofilm er trassig til fjerning og kan føre til økt forekomst av smitteoverføring og antibiotikaresistens. Vedlegget er det første trinnet i biofilmdannelse og er den mest kritiske trinnet på grunn av sin reversibilitet ^1-3. Substrat overflateegenskaper spiller en avgjørende rolle på mikrobiell vedlegg. Faktorer som overflatehardhet, porøsitet, ruhet, og hydrofobisitet er blitt vist å bevirke mikrobiell feste; imidlertid lite forskning å undersøke rollen til substratoverflaten potensial (SP) på mikrobiell adhesjon blitt gjort ^4,5. Negativt ladede overflater hindre festing av Bacillus thuringiensis sporer til glimmer, silisium og gull ^6. Endringer i cellemembranen potensial indikerer endringer i cellulær festing og motilitet ^5,7. Det har blitt observert at elektrisk homogeneous flater lettere fremme mikrobiell vedheft ^5. Karakterisere overflatepotensial av bakterier på nanoskala kan tilveiebringe en ny måte å forstå de adhesjons kinetikken av bakterier til overflater, og derved kan hjelpe til i utviklingen av anti-begroing strategier. I motsetning til andre metoder som brukes for å karakterisere de elektrokinetikken av bakterier, for eksempel elektro lysspredning, zeta-potensial, og isoelektrisk punkt bestemmelse, Kelvin probe mikroskopi (KPFM) gjør det mulig for undersøkelse av enkeltceller i stedet for hele kulturer ^8-11. Dette er gunstig når du ønsker å sammenligne celle-celle eller biofilm elektriske egenskaper med høy nøyaktighet og presisjon.

KPFM er en modul av atomic force mikroskopi (AFM). AFM ble utviklet som et direkte resultat av scanning tunneling mikroskop (STM) ^12. De første publiserte bilder med STM ble gjort av Gerd Binnig og Heinrich Rorhrer i 1982 ¹² </sup>. Deres oppfinnelse var i stand til å løse atomstrukturer ved raster skanne en skarp ledende spiss over en ledende overflate i luften. Implikasjonene av å oppnå høy oppløsning glade biologer som raskt forsøkte å bruke STM til bilde tørkede prøver av DNA, proteiner og virus ^12. STM kan også gjøres i væsker ved hjelp av spesialiserte probetupper ^13. Dette ble vist av Lindsay et al., Som brukt STM og AFM til bilde DNA-molekyler i 10 mM HClO ₄ og i vann, på gullelektroder ^13. KPFM har blitt demonstrert i å bestemme Surface potensialene av DNA og protein analyse ²⁵ og biomolekyler samspill med ligander ^26.

KPFM opererer ved å måle kontaktpotensialforskjell (CPD) mellom en AFM ledende cantilever spiss og en ideelt ledende prøven (figur 1, i) ^14,15. Prøver som ikke nødvendigvis trenger å være ledende (dvs. biologisk samples). Avbildning kan utføres på glimmer, glass og silisium overflater (ikke-ledende), så lenge den ikke-ledende overflate er tynn, og det er en underliggende ledende materiale ^6,7. CPD tilsvarer overflatepotensialet spenning og kan beskrives som forskjellen i arbeidsfunksjonene mellom spissen (φ _spissen) og prøven (φ _prøven) dividert med den negative elektron ladning (- e). Når en ledende AFM spiss er brakt i nærheten av en prøveflate (atskilt med avstanden d), en elektrostatisk kraft _(F-r) blir generert på grunn av forskjellen i Fermi energier (figur 1, ii, a) ^15. På dette punktet, vakuum energier av spissen og prøven (E _v) er i likevekt og innrettet. Ved å bringe den nærmere prøveoverflaten spissen, og spissen prøveoverflaten komme i elektrisk kontakt og virker som parallelle platekondensatorer (figur 1, ii, b </strong>) ^14,15. På det punkt, Fermi energier av spissen og prøven overflaten blir justert, og nådde en stabil tilstand likevekt (figur 1, ii, b). Tuppen og prøveoverflaten vil bli belastet, og en V _CPD vil danne grunn av en forskjell i E _v 's og arbeidsfunksjoner. A F _es virker på den elektriske kontaktområdet på grunn av det dannede V _CPD. Denne kraft blir deretter opphevet gjennom anvendelse av en ekstern V _DC til spissen som har samme størrelsesorden som den dannede V _CPD (figur 1, ii, c). Dette gjelder likespenning eliminerer overflateladning i området av elektrisk kontakt, og mengden av V _DC nødvendig for å fjerne _F-es av V _CPD er lik forskjellen i arbeidsfunksjonene mellom sa-mple overflate og tips ^15. Det skal bemerkes at arbeidsfunksjonen av spissen er kjent, og det er gitt av produsentene. I alle KPFM metoder, en vekselspenning (V _AC, ca 100-500 mV) er også brukt til tuppen for å generere oscillerende elektriske krefter mellom spissen og prøven ^14. Dette gir bedre oppløsning når måling av endringer i V _CPD og / eller F _es. I denne forbindelse, kan endringer i frekvensen eller amplituden av elektrisk oscillasjon korrigeres ved V _DC, og overflate potensielle kartene kan genereres. Data fra bestemte områder av disse kartene kan bli ytterligere analysert for å gi elektrisk informasjon om spesifikke topografiske egenskaper.

KPFM kan brukes i tre modi: (1) Lift funksjon, (2) amplitudemodulasjon (AM) modus, og (3) frekvensmodulasjon (FM) modus ^14,16. Løft modus var den første incarnation av KPFM. Lift-modus avhengig av en to-pass metode der en oscillated tips er dratt over overflaten for å få et topografisk bilde. For det andre passet spissen er hevet en forhåndsinnstilt distanse over prøven (10-100 nm) og skannet tilbake over samme område. På grunn av denne to-pass-metoden, heis modus, sammenlignet med AM og FM-KPFM, tar lengst tid for bildeopptak. Heve spissen bort fra overflaten sikrer at bare lang F _es måles. Dessuten er krysstale mellom topografi og overflatepotensialmålinger dekoblet på bekostning av øket lateral oppløsning og følsomhet.

AM-KPFM forbedrer lateral oppløsning og følsomhet ved hjelp av dual-frekvenser å samtidig måle prøven topografi og overflatepotensial (ett-pass skanning) ^14. I AM modus er cantilever mekanisk oscillert vanligvis 5% under sin første resonansfrekvens (f _0), og elektrisk oscillated (through en V _AC) ved sin andre resonansfrekvens (f _1). Endringer i amplitude av f ₀ ledelse til generering av topografiske data, mens endring i amplitude av f _1, som skyldes endringer i F _es og V _CPD, gi overflate potensielle måledata. f ₀ og f _en av cantilever er atskilt med betydelige frekvenser og energier som signaliserer krysstale er minimert ^14. Den hodeelektronikkboks (HEB) av AFM skiller ut de to signaler for å gi både topografiske og overflate potensielle data samtidig i en skanning. FM-KPFM forbedrer oppløsning enda lenger enn AM-KPFM på biologiske overflater ^14. FM-KPFM fungerer annerledes enn AM-KPFM i at den måler endringer i elektrostatisk kraft gradienter i stedet for elektrostatisk kraft (F _es) ^15. Som AM-modus, utnytter dual-frekvenser og en singl FM-moduse-pass skanning mekanisme for å få topografiske og overflate potensielle data samtidig ^14. I FM-modus, blir braket mekanisk oscillert ved f ₀ og elektrisk oscilleres ved en lav modifisert frekvens (f _mod, typisk 1-5 kHz). Ved elektrostatiske interaksjoner, til f ₀ og f _mod mix produsere sidebånd f ₀ ± f _mod. Disse sidebånd er svært følsomme for endringer i elektrostatisk kraft, og kan skilles fra f ₀ gjennom AFM er HEB. Siden FM-KPFM måler endringer i elektrostatisk kraft gradienter, det tips apex form og vedlikehold / integritet spille en avgjørende rolle i den samlede overflaten potensiell oppløsning ^{14, 15.} Surface potensiell oppløsning ved hjelp av AM og FM-modi er i området 1 nm lateralt ^{14 -16.} Det bør bemerkes at KPFM avbildning kan utføres i ikke-polare væsker, og mer nylig, har vist seg å skje på lavt-ionisk (<10 mm) polare væsker (iåpen sløyfe KPFM moduser som ikke krever en forspenning tilbakemelding, unngår anvendelsen av en DC-forspenning) som MilliQ vann; Men KPFM bildebehandling har ennå ikke gjort på levende celler i polare løsninger ^17-20. Ytterligere utfordringer forbundet med SP avbildning i flytende løsninger, er at vanligvis brukes for å opprettholde celler (dvs. fosfatbufret saltvann) har høye konsentrasjoner av mobile ioner, noe som ville føre til Faraday-reaksjoner, skjevhet-induserte ladnings dynamikk, og ion-diffusjon / omfordeling ^20. Således kan for dette eksperimentet, ble målinger tatt fra tørkede og døde celler MRSA på poly-L-lysin-funksjonaliserte rustfritt stål og gull overflater under omgivelsesbetingelser. Avbildning kan utføres i luft eller i vakuum på biologiske prøver som er blitt tørket eller immobilisert på overflater ^20. Fuktige forhold har også vist seg å påvirke KPFM avbildning av overflater ^6.

I denne studien benyttet vi FM-KPFMog AFM å undersøke rollen til SP på feste av meticillin-resistente Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) til poly-L-lysin-funksjonaliserte rustfritt stål og gull overflater. MRSA har nylig fått status som et multimedikamentresistent (MDR) "super" på grunn av sin naturlige valgt resistens mot mange β-laktam-antibiotika og cefalosporiner ^21. MRSA-infeksjoner er nå mer utfordrende, vanskelig, og utmerket til behandling, som fører til anvendelse av strengere antimikrobielle midler slik som vancomycin eller oksazolidinoner som har høyere toksisitetsnivåer hos mennesker, og kan derfor ikke brukes som langtidsbehandlinger ^22. Rustfritt stål ble valgt på grunn av sin medisinske relevans og felles bruk som materiale i sprøyte nåler, bekken, dørhåndtak, vask, osv Gull ble brukt som en sammenlignende metall. FM-KPFM ble anvendt for å undersøke om mikrobiell membran SP endres ved festing til substrater.

Protocol

1. Utarbeidelse av Glass og kulturer Før du fortsetter med dette eksperimentet, forberede 5% saueblod agar (SBA) plater for voksende MRSA. Inkuber SBA plater i 24 timer ved 37 ° C. Etter denne tid, bør enkelt-, godt isolerte kolonier være tilstede som skal brukes for etterfølgende inokulasjoner i flytende medier. Butikken stripete SBA plater med enkeltkolonier ved 4 ° C i 1 – 2 måneder. MERK: saueblod agarplater kommer i pre-laget pakker som inneholder mellom 20 – 25 plater basert på produsente…

Representative Results

Evnen til å måle SP ved KPFM bygger på prinsippet at både prøveoverflaten og cantilever spissen er ledende til en viss grad. Rustfritt stål og gull fungerte som ledende overflater som MRSA var festet. KPFM bildene ble tatt av 15 MRSA-celler på begge overflater med 512 x 512 oppløsning, og med skanne områder som spenner fra 5 x 5 mikrometer til 10 x 10 mm. Skanning ble gjennomført med linjehastigheter fra 0,02 linjer / sek til 0,05 linjer / sek. Derfor, med 512 datapunkter innsamlet per linje og 512 linjer som …

Discussion

KPFM ble benyttet som en ny teknikk for å fremskaffe overflate elektriske data. Det har ofte blitt brukt som en metode for å undersøke distribusjon kostnad i kjemi og har bare nylig begynt å bli brukt for å studere biologiske systemer på mikro- og nanoskala. Fra de innsamlede dataene fant vi at mikrober ikke synes å lett feste å rengjøre rustfritt stål og gull overflater, selv etter tre timers statisk inkubasjon. Poly-L-lysin funksjon overflater viste rask mikrobiell vedlegg etter 30 min. Lengre inkubasjonstid…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
5500ILM Atomic Force Microscope	Agilent Technologies	#N9435S
AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16219	Stainless steel sample discs
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	There are 4 Pt-coated cantilevers per chip.  We utilized cantilever B for experiments.
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16218-G	Gold sample discs
PicoView Software	Agilent Technologies	#N9797B	5500ILM Atomic Force Microscope imaging software
Pico Image Software (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge	Thomas Scientific	#91201513	Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BD	#221261	Pre-made plates
Tryptic Soy Broth	BD	#257107	Comes as a dry powder.  Instruction on how to make come on the container.