-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.
Abstract
Gereguleerde eiwitafbraak is cruciaal voor vrijwel elke cellulaire functie. Veel van wat bekend is over de moleculaire mechanismen en genetische eisen voor eukaryotische eiwitafbraak werd aanvankelijk opgericht in Saccharomyces cerevisiae. Klassieke analyses van eiwitafbraak hebben vertrouwd op biochemische pulse-chase en cycloheximide-chase methodieken. Hoewel deze technieken gevoelige middelen voor het observeren van afbraak van eiwitten, ze zijn omslachtig, tijdrovend, en een laag-throughput. Deze benaderingen zijn niet vatbaar voor snelle en grootschalige screening van mutaties die eiwitafbraak voorkomen. Hier wordt een gistgroei gebaseerde bepaling voor gemakkelijke identificatie van genetische eisen eiwitafbraak beschreven. In deze bepaling wordt een reporterenzym vereist groei onder bepaalde selectieve omstandigheden gefuseerd aan een instabiele eiwit. Cellen ontbreekt het endogene reporter enzym, maar de uiting van de fusie-eiwit kan groeien onder selective omstandigheden wanneer het fusie-eiwit wordt gestabiliseerd (bijvoorbeeld bij eiwitafbraak gecompromitteerd). In de groei assay beschreven, worden seriële verdunningen van wildtype en mutante gist cellen die een plasmide dat codeert voor een fusie-eiwit gespot op selectieve en niet-selectieve medium. Groei onder selectieve omstandigheden, verenigbaar is met de afbraak bijzondere waardevermindering door een bepaalde mutatie. Verhoogde eiwit overvloed moet biochemisch worden bevestigd. Een werkwijze voor snelle extractie van gisteiwitten in een vorm geschikt voor elektroforese en Western blotting is eveneens aangetoond. Een groei gebaseerde uitlezing voor eiwitstabiliteit, gecombineerd met een eenvoudig protocol voor eiwitextractie voor biochemische analyse, maakt snelle identificatie van genetische eisen eiwitafbraak. Deze technieken kunnen worden aangepast om afbraak van verschillende kortstondige eiwitten volgen. In de gepresenteerde voorbeeld, het HIS3 enzym dat nodig is voor histidine biosynthese werd gefuseerdnaar ° 1 -Sec62. ° 1 -Sec62 is bedoeld voor degradatie na het afwijkend grijpt het endoplasmatisch reticulum translocon. Cellen die ° 1 -Sec62-his3 konden groeien onder selectieve omstandigheden wanneer het eiwit werd gestabiliseerd.
Introduction
Selectieve eiwitafbraak essentieel voor eukaryotische leven en veranderde eiwitafbraak bij tot een aantal medische aandoeningen, waaronder verschillende vormen van kanker, neurodegeneratieve ziekte, cardiovasculaire ziekte, en cystische fibrose 1-5. De ubiquitine-proteasoom-systeem (UPS) die selectieve afbraak van eiwitten katalyseert, is een opkomende therapeutisch doelwit voor deze omstandigheden 6-10. Ubiquitine ligasen covalent polymeren van de 76-aminozuur ubiquitine eiwitten 11. Eiwitten die zijn gemarkeerd met polyubiquitine ketens worden erkend en geproteolyseerd door de ~ 2,5 megadalton 26S-proteasoom 12. Studies gestart in het model eukaryoot organisme Saccharomyces cerevisiae (gist) zijn fundamenteel in de ontrafeling van de mechanismen afbraak van eiwitten in eukaryote cellen geweest. De eerste toonde fysiologische substraat van de UPS is de gist transcriptionele repressor MATα2 1314, en vele sterk geconserveerde delen van de UPS werden eerst geïdentificeerd of gekenmerkt in gist (bijvoorbeeld 15-26). Ontdekkingen gedaan in deze veelzijdige en genetisch handelbaar modelorganisme zijn waarschijnlijk blijven belangrijke inzichten verschaffen in geconserveerde mechanismen van ubiquitine gemedieerde afbraak.
Erkenning en degradatie van de meeste UPS ondergronden vereisen een gecoördineerde actie van meerdere eiwitten. Daarom is een belangrijk doel bij het karakteriseren van de geregelde afbraak van een bepaalde instabiele eiwit de genetische vereisten voor proteolyse bepalen. Klassieke benaderingen (bijv pulse-chase en cycloheximide-chase experimenten 27) voor het controleren eiwitafbraak bij zoogdier- of gistcellen zijn omslachtig en tijdrovend. Hoewel deze soorten methodologie gevoelige middelen voor het detecteren van eiwitafbraak, ze zijn niet geschikt voor snelle analyse van eiwitafbraak of grootschalige screening voor mutaties die eiwitafbraak voorkomen. Hier wordt een gistgroei-gebaseerde assay voor de snelle identificatie van genetische eisen voor de afbraak van instabiele eiwitten gepresenteerd.
In de gistgroei-methode voor het analyseren van eiwitafbraak, een instabiel eiwit van belang (of afbraak signaal) gefuseerd in frame, een eiwit dat nodig is voor groei van gist onder bepaalde omstandigheden. Het resultaat is een kunstmatig substraat dat als een krachtig instrument voor de genetische eisen van eiwitafbraak van het instabiele eiwit van belang te bepalen kan dienen. Gunstig, meest gebruikte laboratorium giststammen bevatten een paneel van mutaties in genen die coderen voor metabole enzymen betrokken bij de biosynthese van bepaalde aminozuren of stikstofhoudende basen (bv 20,28-30). Deze enzymen zijn essentieel voor cellulaire proliferatie in afwezigheid van exogeen geleverd metabolieten in de synthese waarvan de enzymen deelnemen. Zodanigmetabolische enzymen kunnen derhalve fungeren als groei gebaseerde reporters voor de afbraak van onstabiele eiwitten waaraan zij gefuseerd. De genetische eisen voor eiwitafbraak kunnen gemakkelijk worden toegelicht, aangezien mutaties die proteolyse voorkomen zal cellen die de afbraak reporter groeien onder selectieve omstandigheden.
Een groei voordeel is een indirecte indicatie dat een bepaalde mutatie verhoogt de overvloed van het eiwit van interesse. Echter, wordt direct biochemische analyse vereist om te bevestigen dat een mutatie maakt groei door verhoogde eiwitgehaltes in plaats van via indirecte of artefactuele oorzaken. Het effect van een mutatie op proteïne overvloed kan worden bevestigd door western blot analyse van steady-state eiwit niveaus in cellen die wel en niet haven de specifieke mutatie. Een werkwijze voor snelle en efficiënte extractie van gisteiwitten (sequentiële incubatie van gistcellen met natriumhydroxide en monsterbuffer) in een vorm geschiktvoor analyse door western blotting wordt ook gepresenteerd 31. Samen vormen deze experimenten te vergemakkelijken de snelle identificatie van kandidaat-regulatoren van eiwitafbraak.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde methode laat een snelle bepaling en biochemische bevestiging van genetische eisen eiwitafbraak in gistcellen. Deze experimenten benadrukken het nut en de kracht van gist als model eukaryoot organisme (meerdere uitstekende recensies van gist biologie en compilaties van protocollen voor de behandeling, de opslag en het manipuleren van gistcellen (bijvoorbeeld 41-44) zijn beschikbaar voor nieuwe onderzoekers het organisme). De technieken kunnen gemakkelijk worden toegepast voor de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de huidige en voormalige leden van de Rubenstein lab voor het verstrekken van een ondersteunende en enthousiaste onderzoeksomgeving. Wij danken Ryan T. Gibson voor hulp bij het protocol optimalisatie. Wij danken Mark Hochstrasser (Yale University) en Dieter Wolf (Universität Stuttgart) voor giststammen en plasmiden. Wij danken onze anonieme reviewers voor hun hulp bij het verbeteren van de duidelijkheid en het nut van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door een onderzoek award van het hoofdstuk Ball State University van Sigma Xi naar SGW, een National Institutes of Health subsidie (R15 GM111713) aan EMR, een Ball State University ASPiRE onderzoek award voor EMR, en fondsen van de Ball State University Provost's Office en het Departement Biologie.
Materials
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
| 3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs |
| Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer |
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
| Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) |
Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
References
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
- Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
- Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, S11 (2007).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
- Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
- Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
- Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 192, 319-360 (2012).
- Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
- Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
- Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
- Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
- Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
- Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
- Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
- Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
- Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
- Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
- Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
- Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
- Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 122, 19-27 (1989).
- Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093 (2012).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
- Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
- Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
- Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
- Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
- Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
- Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
- Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
- Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
- Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. . Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. 유전학. 197, 33-48 (2014).
- Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , (2004).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
- Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
- Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
- Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
- Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
- Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
- Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
- Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
- Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791 (2012).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
- Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
- Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).
