JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Определение на основе экономического роста и биохимическая Подтверждение генетическим требованиям белка деградации в<em> Saccharomyces Cerevisiae</em

Published: February 16, 2015
doi:
10.3791/52428
, , ,
1Department of Biology,Ball State University, 2Division of Nephrology,Cincinnati Children’s Hospital

Summary

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Abstract

Деградация Регулируемый белок имеет решающее значение практически для каждого клеточной функции. Многое из того, что известно о молекулярных механизмах и генетических требований к деградации эукариотической белка была первоначально создана в Saccharomyces CEREVISIAE. Классические анализ деградации белков полагались на биохимические импульсно-Чейз и циклогексимид погони методологий. Хотя эти методы обеспечивают чувствительные средства для наблюдения деградации белка, они являются трудоемкими, отнимающим много времени, и низкая пропускная способность. Эти подходы не поддаются быстрому или крупномасштабного скрининга мутаций, которые предотвращают деградацию белка. Здесь дрожжи роста на основе анализа для поспешном идентификации генетических требований к деградации белков описано. В этом анализе, фермент-репортер требуется для роста в конкретных условиях селективного слит с неустойчивой белка. Клетки, не имеющие эндогенного фермента-репортера, но, экспрессирующие слитый белок может расти в СелеCTIVE условия только тогда, когда слитый белок стабилизируют (т.е. при деградации белка нарушена). В анализе роста, описанного здесь, серийные разведения дикого типа и мутантных клеток дрожжей, несущих плазмиду, кодирующую слитый белок, наносили на селективной и неселективной среды. Рост в селективных условиях в соответствии с обесценение деградации данного мутации. Увеличение белка обилие должны быть биохимически подтверждено. Способ быстрого извлечения дрожжевых белков в форме, подходящей для электрофореза и Вестерн-блоттинга также продемонстрировал. Считывание рост на основе стабильности белка, в сочетании с простым протоколом для экстракции белка для биохимического анализа, облегчает быструю идентификацию генетических требований к деградации белка. Эти методы могут быть адаптированы для мониторинга деградации различных короткоживущих белков. В примере, представленном фермент HIS3, который необходим для биосинтеза гистидина, был слитв Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 предназначен для деградации после аномально занимается эндоплазматической сети транслокон. Клетки, несущие Deg1 -Sec62-his3 удалось вырастить в селективных условиях, когда белок был стабилизирован.

Introduction

Селективный деградации белка имеет важное значение для эукариотической жизни, и деградация измененный белок способствует ряда заболеваний, в том числе некоторых видов рака, нейродегенеративных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, и кистозный фиброз 1-5. Система убиквитин-протеасомный (ИБП), который катализирует селективное разрушение белка, является новым терапевтической мишенью для этих условий 6-10. Убиквитин-лигазы ковалентно присоединить полимеры убиквитина 76-аминокислота белков 11. Белки, которые были отмечены с полиубиквитиновый цепей признаются и proteolyzed по ~ 2,5 megadalton 26S протеасом 12. Исследования, начатые в модели эукариотических организмов Saccharomyces Cerevisiae (почкованием дрожжей) были основополагающими в выяснении механизмов деградации белка в эукариотических клетках. Впервые продемонстрирована физиологический субстрат ИБП был дрожжи транскрипции репрессор MATα2 13, 14, и многие высоко консервативные компоненты ИБП впервые были определены или отличающийся тем, дрожжей (например, 15-26). Открытия, сделанные в этом универсальном и генетически послушный модельного организма, скорее всего, продолжит оказывать важную информацию консервативных механизмов убиквитин-опосредованной деградации.

Признание и деградация большинства субстратов ИБП требуют совместных действий нескольких белков. Таким образом, важной задачей при характеристике регулируемого деградации данного нестабильной белка, чтобы определить генетические требования для протеолиза. Классические методы (например, импульсно-чейз и циклогексимид-чейз-эксперименты 27) для мониторинга деградации белка в млекопитающих или дрожжевые клетки трудоемким и занимает много времени. В то время как эти типы методологии обеспечивают высоко чувствительные средства для детектирования деградацию белков, они не подходят для быстрого анализа деградации белка или крупномасштабного screeniнг для мутаций, которые предотвращают деградацию белка. Здесь дрожжи роста на основе тест для быстрой идентификации генетических требований к деградации неустойчивых белков представлены.

В дрожжей на основе экономического роста метод анализа деградации белка, неустойчивый интерес белок (или деградации сигнала) сливают, в рамке, с белком, который необходим для роста дрожжей при определенных обстоятельствах. Результатом является искусственный субстрат, который может служить в качестве мощного инструмента для определения генетического требованиям деградации белков нестабильной белка. Удобно, наиболее часто используемые дрожжевые штаммы лаборатории укрывает панель мутаций в генах, кодирующих метаболические ферменты, участвующие в биосинтезе определенных аминокислот или азотистых оснований (например, 20,28-30). Эти ферменты имеют важное значение для клеточной пролиферации в отсутствие экзогенно предоставленных метаболитов в которых синтез ферменты участвуют. Такиеметаболические ферменты могут, таким образом, функционировать в качестве роста на основе репортеры за деградацию нестабильных белков, к которым они слиты. Генетические требования к деградации белков могут быть легко объяснены, так как мутации, которые предотвращают протеолиз позволит клетки, несущие деградации репортер расти при селективных условиях.

Преимущество рост косвенным свидетельством того, что особенности мутация увеличивает изобилие белка. Тем не менее, прямой биохимический анализ необходим, чтобы подтвердить, что мутация позволяет рост за счет увеличения содержания белка, а не через косвенные или артефактом причин. Эффект мутации на белковой изобилии, может быть подтверждено с помощью Вестерн-блот анализа уровней стационарных белка в клетках, что делать, и не питают особого мутацию. Способ быстрого и эффективного извлечения дрожжевых белков (последовательной инкубацией клеток дрожжей с помощью гидроксида натрия и образец буфера) в форме, пригоднойдля анализа с помощью Вестерн-блоттинга также представлены 31. Вместе, эти эксперименты содействия скорейшей идентификации регуляторов кандидатов деградации белка.

Protocol

1. Дрожжи Анализ роста к выявления возможных мутантов, дефектных по Protein деградации Преобразование дикого типа и мутантных клеток дрожжей с плазмидой, кодирующей нестабильную белок, слитый в рамке, с репортером метаболического фермента. Посев трансформантов в 5 мл синтетиче?…

Representative Results

Чтобы проиллюстрировать эту методологию, фермент HIS3 был слит с карбокси-конца модели эндоплазматического ретикулума (ER) -associated деградации (ERAD) подложки, Deg1 -Sec62 (2А), чтобы создать Deg1 -Sec62-HIS3 (фиг.3) . Deg1 -Sec62 представляет членом-основателем нового класса ERAD су?…

Discussion

Методология, представленные здесь позволяет для быстрого определения и биохимического подтверждения генетических требований к деградации белков в дрожжевых клетках. Эти эксперименты выделить полезность и власть дрожжей в качестве модели эукариотических организмов (несколько отли?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим нынешних и бывших членов лаборатории Рубинштейн для обеспечения благоприятных и энтузиазма исследовательскую среду. Мы благодарим Райана Т. Гибсон за помощь в оптимизации протокола. Мы благодарим Отметить Хохштрассер (Йельский университет) и Дитер Вольф (Universität Stuttgart) для штаммов дрожжей и плазмид. Мы благодарим наших рецензентов за их помощь в улучшении ясности и полезности этой рукописи. Эта работа была поддержана научным награду от главы Ball State University Сигма Кси к SGW, Национальный институт гранта здравоохранения (R15 GM111713), чтобы ЭМИ, исследования награда Ball State University стремиться к ЭМИ, а также средства от Ball State University Управление приорство и биологический факультет.

Materials

Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole Fisher Scientific AC264571000 Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) Roche 11088726001 May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped Sarstedt 82.1581.001 Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl Gilson F14403 Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl Gilson F14401 Available from a variety of manufacturers
Plate imaging system (e.g.
Gel Doc XR+ System)		 Bio-Rad 170-8195 A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater Fisher Scientific 1172011AQ Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  2. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
  3. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
  4. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
  5. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, S11 (2007).
  6. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  7. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
  8. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
  9. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 192, 319-360 (2012).
  11. Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
  12. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
  13. Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
  14. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  15. Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
  16. Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
  17. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
  18. Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
  19. Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
  20. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
  21. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
  22. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
  23. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
  24. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
  25. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
  26. Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
  27. Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
  28. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
  29. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 122, 19-27 (1989).
  30. Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093 (2012).
  31. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
  32. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
  33. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
  34. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
  35. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
  36. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
  37. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
  38. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
  39. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
  40. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
  41. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. . Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
  42. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. 유전학. 197, 33-48 (2014).
  43. Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , (2004).
  44. Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
  45. Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
  46. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
  47. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
  48. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
  49. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
  50. Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
  51. Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
  52. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
  53. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
  54. Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
  55. Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
  56. Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791 (2012).
  57. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
  58. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921 (2013).
  59. Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).

Tags

Keywords: Protein DegradationSaccharomyces CerevisiaeGrowth-based AssayReporter EnzymeDeg1-Sec62-His3 FusionGenetic RequirementsBiochemical ConfirmationProtein ExtractionWestern BlottingEndoplasmic Reticulum Translocon
check_url/kr/52428?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (96), e52428, doi:10.3791/52428 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image