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생물학

Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en<em> Saccharomyces cerevisiae</em

Published: February 16, 2015
doi:
10.3791/52428
, , ,
1Department of Biology,Ball State University, 2Division of Nephrology,Cincinnati Children’s Hospital

Summary

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Abstract

La degradación de proteínas regulado es crucial para prácticamente todas las funciones celulares. Gran parte de lo que se conoce acerca de los mecanismos moleculares y los requisitos genéticos para la degradación de proteínas eucariotas se estableció inicialmente en Saccharomyces cerevisiae. Los análisis clásicos de la degradación de proteínas se han basado en pulso-caza y cicloheximida-caza metodologías bioquímicas. Aunque estas técnicas proporcionan medios sensibles para la observación de la degradación de proteínas, que son laboriosos, consumen mucho tiempo, y de bajo rendimiento. Estos enfoques no son susceptibles de cribado rápido o a gran escala para las mutaciones que impiden la degradación de proteínas. Aquí, se describe un ensayo basado en el crecimiento de la levadura para la identificación fácil de los requisitos genéticos para la degradación de la proteína. En este ensayo, una enzima reportero requerido para el crecimiento bajo condiciones selectivas específicas se fusiona a una proteína inestable. Las células que carecen de la enzima reportero endógena pero que expresan la proteína de fusión puede crecer bajo selecondiciones ctive sólo cuando se estabiliza la proteína de fusión (es decir, cuando se ve comprometida la degradación de proteínas). En el ensayo de crecimiento descrito aquí, diluciones en serie de tipo salvaje y células de levadura mutantes que albergan un plásmido que codifica una proteína de fusión se manchan sobre medio selectivo y no selectivo. Crecimiento en condiciones selectivas es consistente con la degradación de deterioro por una mutación dada. El aumento de la abundancia de proteínas debe ser confirmada bioquímicamente. Un método para la rápida extracción de proteínas de levadura en una forma adecuada para la electroforesis y transferencia Western también se demuestra. Una lectura basada en el crecimiento para la estabilidad de la proteína, combinado con un protocolo sencillo para la extracción de proteína para el análisis bioquímico, facilita la rápida identificación de los requisitos genéticos para la degradación de la proteína. Estas técnicas se pueden adaptar para controlar la degradación de una variedad de proteínas de vida corta. En el ejemplo presentado, la enzima His3, que se requiere para la biosíntesis de histidina, se fusionóa Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 está destinada a la degradación después de que encaje de forma aberrante translocón retículo endoplásmico. Las células que albergan Deg1 -Sec62-His3 fueron capaces de crecer en condiciones selectivas cuando se estabilizó la proteína.

Introduction

La degradación de proteínas selectiva es esencial para la vida eucariota, y la degradación de proteínas alterada contribuye a una serie de condiciones médicas, incluyendo varios tipos de cáncer, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares, y la fibrosis quística 1-5. El sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), que cataliza la degradación selectiva de proteínas, es una diana terapéutica emergente para estas condiciones 6-10. Ubiquitina ligasas unir covalentemente polímeros de la ubiquitina de ácido 76-amino de proteínas 11. Las proteínas que se han marcado con cadenas poliubiquitina son reconocidos y proteolizadas por los ~ 2.5 megadalton proteasoma 26S 12. Los estudios iniciados en el organismo eucariota modelo Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes) han sido fundamental en la elucidación de los mecanismos de degradación de proteínas en células eucariotas. El primer sustrato fisiológico demostrada del UPS era la levadura represor transcripcional MATα2 13, Primero se identificaron 14, y muchos componentes altamente conservadas de la UPS o caracterizadas en la levadura (por ejemplo, 15-26). Los descubrimientos hechos en este modelo versátil y manejable de forma genética organismo es probable que continúe proporcionando importantes conocimientos sobre conservados mecanismos de degradación mediada por ubiquitina.

El reconocimiento y la degradación de la mayoría de los sustratos de UPS requieren la acción concertada de múltiples proteínas. Por lo tanto, un objetivo importante en la caracterización de la degradación regulada de una proteína dada es inestable para determinar los requisitos genéticos para la proteólisis. Los enfoques clásicos (por ejemplo de pulso-caza y experimentos cicloheximida-caza 27) para el seguimiento de la degradación de proteínas en células de mamífero o de levadura son laborioso y consume mucho tiempo. Si bien estos tipos de metodología proporcionan medios altamente sensibles para la detección de la degradación de proteínas, que no son adecuados para el análisis rápido de la degradación de proteína o Prueba de detección a gran escalang para mutaciones que impiden la degradación de proteínas. Aquí, se presenta un ensayo basado en un crecimiento de la levadura para la rápida identificación de los requisitos genéticos para la degradación de las proteínas inestables.

En el método basado en el crecimiento de la levadura para el análisis de la degradación de proteínas, una proteína inestable de interés (o señal de degradación) se fusiona, en marco, a una proteína que se requiere para el crecimiento de la levadura bajo circunstancias específicas. El resultado es un sustrato artificial que puede servir como una herramienta de gran alcance para determinar los requisitos genéticos de degradación de las proteínas de la proteína inestable de interés. Convenientemente, las cepas de levadura de laboratorio más comúnmente utilizados albergan un panel de mutaciones en genes que codifican enzimas metabólicas implicadas en la biosíntesis de aminoácidos particulares o bases nitrogenadas (por ejemplo, 20,28-30). Estas enzimas son esenciales para la proliferación celular en ausencia de proporcionadas exógenamente metabolitos en cuya síntesis las enzimas participan. Talenzimas metabólicas pueden así funcionar como reporteros basadas en el crecimiento de la degradación de las proteínas inestables a las que se fusionan. Los requisitos genéticos para la degradación de la proteína pueden ser dilucidado fácilmente, ya que las mutaciones que impiden la proteolisis se permitir que las células que albergan el reportero de la degradación crezcan bajo condiciones selectivas.

Una ventaja de crecimiento es una indicación indirecta de que una mutación particular aumenta la abundancia de la proteína de interés. Sin embargo, se requiere un análisis bioquímico directo a confirmar que una mutación permite el crecimiento mediante el aumento de los niveles de proteína en lugar de a través de las causas indirectas o artefactos. El efecto de una mutación en la abundancia de proteínas puede ser confirmado por Western blot de los niveles de proteína en estado de equilibrio en las células que hacen y no albergan la mutación particular. Un método para la extracción rápida y eficiente de las proteínas de levadura (incubación secuencial de células de levadura con hidróxido de sodio y tampón de muestra) en una forma adecuadapara el análisis por transferencia de Western también se presenta 31. En conjunto, estos experimentos facilitar la rápida identificación de los reguladores candidatos de la degradación de proteínas.

Protocol

1. Ensayo de crecimiento de la levadura para identificar mutantes candidatos defectuosos en la degradación de proteínas Transformar de tipo salvaje y células de levadura mutante con un plásmido que codifica una proteína inestable fusionado, en cuadro, a una enzima metabólica reportero. Inocular los transformantes en 5 ml de sintético definido (SD) medio mínimo que es selectivo para células que albergan moléculas de plásmido. Incubar durante la noche a 30 ° C, en rotación. Medi…

Representative Results

Para ilustrar esta metodología, la enzima His3 se ha fusionado con el extremo carboxi-terminal del modelo de retículo endoplásmico (ER) la degradación -Associated (ERAD) sustrato, Deg1 -Sec62 (Figura 2A) para crear Deg1 -Sec62-His3 (Figura 3) . Deg1 -Sec62 representa uno de los fundadores de una nueva clase de sustratos ERAD que están dirigidos siguiente persistente, asociación aberrante con la translocon, el canal de los principales responsables de las …

Discussion

La metodología que aquí se presenta permite la determinación rápida y la confirmación bioquímica de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas en células de levadura. Estos experimentos ponen de relieve la utilidad y el poder de la levadura como un organismo eucariota modelo (varios excelentes críticas de la biología de la levadura y compilaciones de protocolos para el manejo, almacenamiento y manipulación de células de levadura (por ejemplo 41-44) están disponibles para…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Damos las gracias a los miembros actuales y anteriores del laboratorio Rubenstein para proporcionar un entorno de investigación y de apoyo entusiasta. Agradecemos a Ryan T. Gibson para la ayuda en la optimización del protocolo. Damos las gracias a Marcos Hochstrasser (Universidad de Yale) y Dieter Wolf (Universität Stuttgart) para las cepas de levadura y plásmidos. Agradecemos a nuestros revisores anónimos por su ayuda en la mejora de la claridad y la utilidad de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un premio de investigación del capítulo de la Universidad Ball State de Sigma Xi a SGW, los Institutos Nacionales de Salud de subvención (R15 GM111713) para EMR, un premio de investigación de la Universidad Ball State aspirar a EMR, y los fondos de la Universidad Ball State Oficina del Rector y del Departamento de Biología.

Materials

Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory.
3-amino-1H-1,2,4-triazole Fisher Scientific AC264571000 Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) Roche 11088726001 May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped Sarstedt 82.1581.001 Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl Gilson F14403 Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl Gilson F14401 Available from a variety of manufacturers
Plate imaging system (e.g.
Gel Doc XR+ System)		 Bio-Rad 170-8195 A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heater Fisher Scientific 1172011AQ Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application
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Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (96), e52428, doi:10.3791/52428 (2015).
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