Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.
Abstract
Geregelten Proteinabbau ist entscheidend für praktisch jede Zellfunktion. Vieles von dem, was über die molekularen Mechanismen und genetischen Erfordernisse für eukaryotische Proteinabbau bekannt wurde zunächst in Saccharomyces cerevisiae hergestellt. Klassische Analysen der Proteinabbau haben biochemische Pulse-Chase und Cycloheximid-Chase-Methoden verlassen. Während diese Techniken empfindliche Mittel zur Beobachtung des Proteinabbaus sind mühsam, zeitaufwendig und niedrigem Durchsatz. Diese Ansätze sind nicht geeignet, um eine schnelle und großflächige Screening auf Mutationen, die den Proteinabbau zu verhindern. Hier wird ein Wachstum der Hefe-basierenden Assay für die leichte Identifizierung von genetischen Erfordernisse für den Proteinabbau beschrieben. In diesem Test wird ein Reporterenzym für das Wachstum unter bestimmten Selektionsbedingungen erforderlich, um ein instabiles Protein fusioniert ist. Zellen, denen das endogene Reporter-Enzym exprimieren, aber das Fusionsprotein unter sele wachsenctive Bedingungen nur, wenn das Fusionsprotein stabilisiert ist (dh, wenn der Proteinabbau gefährdet ist). Bei dem hier beschriebenen Wachstumstest werden Verdünnungsreihen von Wildtyp und mutierten Hefezellen ein Plasmid ein Fusionsprotein kodiert, auf selektiven und nicht-selektiven Medium entdeckt. Wachstum unter selektiven Bedingungen entspricht Abbau Beeinträchtigung von einer bestimmten Mutation. Erhöhte Proteinmenge sollte biochemisch bestätigt werden. Ein Verfahren zur schnellen Extraktion von Hefe-Proteinen in einer für die Elektrophorese und Western-Blotting Form wird auch gezeigt. Ein Wachstum basierende Auslesen für die Proteinstabilität, kombiniert mit einer einfachen Protokoll für die Proteinextraktion zur biochemischen Analyse, erleichtert die schnelle Identifizierung von genetischen Erfordernisse für den Proteinabbau. Diese Techniken können angepaßt, um den Abbau einer Vielzahl von kurzlebigen Proteinen zu überwachen. In dem dargestellten Beispiel des HIS3-Enzym, das für die Biosynthese von Histidin erforderlich ist, fusioniertum deg1 -Sec62. deg1 -Sec62 ist für den Abbau gezielt nach der aberrant die Endoplasmatischen Retikulum Translokon einrastet. Zellen, die deg1 -Sec62-His3 konnten unter selektiven Bedingungen wachsen, wenn das Protein stabilisiert wurde.
Introduction
Selektive Proteinabbau ist für eukaryontische Leben und veränderten Proteinabbau trägt zu einer Reihe von Erkrankungen, einschließlich verschiedene Arten von Krebs, neurodegenerativen Erkrankungen, Herz-Kreislaufkrankheiten und Mukoviszidose 1-5. Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS), die selektive Proteinabbau katalysiert, ist eine aufstrebende therapeutisches Ziel für diesen Bedingungen 10.6. Ubiquitin-Ligase kovalent an Polymere der 76-Aminosäure-Ubiquitin an Proteine 11. Proteine, die mit Polyubiquitinketten markiert wurden, werden erkannt und durch die ~ 2,5 Megadalton 26S Proteasom proteolysiert 12. Studien im Modell eukaryotischen Organismus Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) initiiert wurden grund bei der Aufklärung von Proteinabbaumechanismen in eukaryotischen Zellen. Der erste Beweis physiologischen Substrat der USV war die Hefe Transkriptionsrepressor MATα2 13, 14, und viele hoch konservierte Komponenten des UPS wurden zuerst identifiziert oder gekennzeichnet Hefe (zB 15-26). Entdeckungen in diesem vielseitigen und genetisch manipulierbaren Modellorganismus hergestellt werden wahrscheinlich weiterhin wichtige Einblicke in konservierten Mechanismen des Ubiquitin-vermittelten Abbau liefern.
Anerkennung und Abbau der meisten UPS Substrate erfordern die konzertierte Aktion von mehreren Proteinen. Daher ist ein wichtiges Ziel bei der Charakterisierung des geregelten Abbau einer bestimmten instabilen Protein die genetischen Erfordernisse für die Proteolyse zu bestimmen. Klassische Ansätze (zB Pulse-Chase und Cycloheximid-Chase-Experimente 27) zur Überwachung der Proteinabbau in Säugetier- oder Hefezellen sind mühsam und zeitaufwendig. Während diese Art von Methode bereitzustellen hochempfindliche Einrichtung zum Erfassen des Proteinabbaus für eine schnelle Analyse des Proteinabbaus oder Groß screeni sind sie nichtng für Mutationen, die den Proteinabbau zu verhindern. Hier wird ein Wachstum der Hefe-basierenden Assay zur schnellen Identifizierung von genetischen Erfordernisse für den Abbau von instabilen Proteinen präsentiert.
Im Hefewachstum basiertes Verfahren zur Analyse von Protein-Abbau, ein instabiles Protein von Interesse (oder Abbausignals) fusioniert, im Rahmen, ein Protein, das für das Wachstum der Hefe unter bestimmten Umständen erforderlich ist. Das Ergebnis ist ein künstliches Substrat, das als ein mächtiges Werkzeug, um die genetischen Voraussetzungen des Proteinabbaus der instabilen Protein von Interesse festzustellen, dienen können. Zweckmßigerweise beherbergen am häufigsten verwendeten Labor Hefestämme eine Gruppe von Mutationen in Genen, die Stoffwechselenzyme in der Biosynthese von bestimmten Aminosäuren oder stickstoffhaltigen Basen (zB 20,28-30) beteiligt kodiert. Diese Enzyme sind für die zelluläre Proliferation in Abwesenheit von exogen bereitgestellt Metaboliten in deren Synthese der Enzyme beteiligt. Sometabolische Enzyme können so als Wachstumsbasis Reporter für den Abbau von instabilen Proteinen, denen sie fusioniert sind. Die genetischen Voraussetzungen für den Proteinabbau kann leicht erklärt werden, da Mutationen, die Proteolyse zu verhindern, können Zellen, die das Abbau Reporter, unter selektiven Bedingungen wachsen.
Einen Wachstumsvorteil ist ein indirekter Hinweis auf eine bestimmte Mutation erhöht die Häufigkeit des Proteins von Interesse. Allerdings ist direkte biochemische Analyse erforderlich, um zu bestätigen, dass eine Mutation ermöglicht Wachstum durch erhöhte Protein-Ebene und nicht durch indirekte oder Artefakt Ursachen. Die Wirkung einer Mutation auf Proteinmenge kann durch Western-Blot-Analyse der Steady-State-Protein-Spiegel in den Zellen, und tun nicht die bestimmte Mutation beherbergen bestätigt werden. Ein Verfahren für die schnelle und effiziente Gewinnung von Hefeproteinen (sequentielle Inkubation der Hefezellen mit Natriumhydroxid und Probenpuffer) in einer geeigneten Formfür die Analyse durch Western-Blot wird ebenfalls vorgestellt 31. Zusammen stellen diese Experimente ermöglichen die schnelle Identifizierung von Kandidatenregulatoren der Proteinabbau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellte Methode erlaubt die schnelle Bestimmung und biochemischen Bestätigung genetischen Erfordernisse für den Proteinabbau in Hefezellen. Diese Experimente unterstreichen den Nutzen und die Kraft der Hefe als Modell eukaryotischen Organismus (mehrere ausgezeichnete Bewertungen von Hefe Biologie und Zusammenstellungen von Protokollen für die Handhabung, Speicherung und Manipulation von Hefezellen (zB 41 bis 44) sind für die Ermittler neue für den Organismus verfügbar). Die Techni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Rubenstein Labor zur Bereitstellung eines unterstützenden und begeisterten Forschungsumfeld. Wir danken Ryan T. Gibson um Hilfe bei der Protokolloptimierung. Wir danken Markus Hochstrasser (Yale University) und Dieter Wolf (Universität Stuttgart) für Hefestämme und Plasmide. Wir danken unseren anonymen Gutachtern für ihre Hilfe bei der Verbesserung der Klarheit und Nützlichkeit dieses Manuskript. Diese Arbeit wurde von einem Forschungspreis der Ball State University Kapitel der Sigma Xi zu SGW unterstützt, ein National Institutes of Health Zuschuss (R15 GM111713) zu EMR, ein Ball State University ASPiRE Forschungspreis zur EMR und Mittel aus der Ball State University Provost Büro und Fachbereich Biologie.
Materials
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
| 3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs |
| Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer |
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
| Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) |
Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
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