Détermination basée sur la croissance et la confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.
Abstract
La dégradation des protéines réglementé est crucial pour pratiquement toutes les fonctions cellulaires. Une grande partie de ce qui est connu sur les mécanismes moléculaires et génétiques exigences pour la dégradation des protéines eucaryotes a été initialement créé en Saccharomyces cerevisiae. Analyses classiques de la dégradation des protéines se sont appuyés sur pulse-chase et cycloheximide-chase méthodes biochimiques. Bien que ces techniques fournissent des moyens sensibles pour observer la dégradation des protéines, ils sont laborieux, de temps, et à faible débit. Ces approches ne sont pas aptes à la sélection rapide ou à grande échelle pour des mutations qui empêchent la dégradation des protéines. Ici, un test basé sur une croissance de la levure pour l'identification facile des exigences génétiques pour la dégradation des protéines est décrite. Dans ce dosage, une enzyme rapporteur nécessaire à la croissance dans des conditions sélectives spécifiques est fusionnée à une protéine instable. Les cellules dépourvues de l'enzyme rapporteur endogène mais qui expriment la protéine de fusion peut se développer sous sélective conditions que lorsque la protéine de fusion est stabilisé (lorsque la dégradation des protéines est compromise). Dans l'essai de croissance décrit ici, des dilutions en série de type sauvage et des cellules de levure mutantes qui hébergent un plasmide codant pour une protéine de fusion sont déposés sur un milieu sélectif et non-sélectif. Croissance dans des conditions sélectives est compatible avec la dégradation dépréciation par une mutation donnée. L'abondance de la protéine accrue devrait être confirmé biochimiquement. Procédé pour l'extraction rapide de protéines de levure sous une forme appropriée pour l'électrophorèse et transfert de Western est également démontrée. Une lecture basée sur la croissance pour la stabilité de la protéine, combinée avec un simple protocole d'extraction de protéines pour l'analyse biochimique, facilite l'identification rapide des exigences génétiques pour la dégradation des protéines. Ces techniques peuvent être adaptées pour surveiller la dégradation d'une variété de protéines de courte durée. Dans l'exemple présenté, l'enzyme His3, qui est nécessaire pour la biosynthèse de l'histidine, a été fusionnéà DEG1 -Sec62. DEG1 -Sec62 est prévue pour dégradation après ce qu'il se engage aberrante le réticulum endoplasmique translocon. Cellules hébergeant DEG1 -Sec62-His3 sont capables de croître dans des conditions sélectives lorsque la protéine a été stabilisé.
Introduction
La dégradation sélective des protéines est essentielle à la vie eucaryote, et la dégradation de la protéine altérée contribue à un certain nombre de maladies, y compris plusieurs types de cancer, les maladies neurodégénératives, les maladies cardiovasculaires, et la fibrose kystique 1-5. Le système ubiquitine-protéasome (UPS), qui catalyse la dégradation sélective des protéines, est une cible thérapeutique émergeant de ces conditions 6-10. ubiquitine ligases attachent de manière covalente des polymères de l'acide 76-ubiquitine aminés aux protéines 11. Les protéines qui ont été marqués avec des chaînes de polyubiquitine sont reconnus et protéolysée par les ~ 2,5 mégadaltons protéasome 26S 12. Études initiées dans l'organisme eucaryote modèle Saccharomyces cerevisiae (levure en herbe) ont été fondamental dans l'élucidation des mécanismes de dégradation des protéines dans les cellules eucaryotes. Le premier substrat physiologique démontré de l'onduleur était la levure répresseur transcriptionnel MATα2 13, 14, et de nombreux composants hautement conservées de la première UPS ont été identifiés ou caractérisés dans la levure (par exemple 15-26). Les découvertes faites dans cet organisme modèle polyvalent et génétiquement traitable sont susceptibles de continuer à fournir des informations importantes sur les mécanismes conservés de la dégradation des ubiquitine.
Reconnaissance et de la dégradation de la plupart des substrats UPS requièrent une action concertée de plusieurs protéines. Par conséquent, un objectif important dans la caractérisation de la dégradation régulée d'une protéine donnée est instable pour déterminer les exigences génétiques pour la protéolyse. Les approches classiques (par exemple pulse-chase et expériences cycloheximide-chase 27) pour surveiller la dégradation des protéines dans des cellules de mammifère ou de levure sont laborieuses et prennent du temps. Bien que ces types de méthodologie fournissent des moyens très sensibles pour détecter la dégradation des protéines, ils ne conviennent pas pour l'analyse rapide de la dégradation des protéines ou à grande échelle screening pour les mutations qui empêchent la dégradation des protéines. Ici, une analyse basée sur la croissance de la levure pour l'identification rapide des exigences génétiques pour la dégradation des protéines instables est présentée.
Dans la méthode de la croissance de la levure pour l'analyse de la dégradation des protéines, une protéine instable d'intérêt (ou un signal de dégradation) est fusionnée, en cadre, à une protéine qui est nécessaire pour la croissance de la levure dans des circonstances particulières. Le résultat est un substrat artificiel qui peut servir comme un outil puissant pour déterminer les exigences génétiques de la dégradation des protéines de la protéine d'intérêt instable. Idéalement, les souches de levure de laboratoire les plus couramment utilisés abritent un panel de mutations dans les gènes codant pour des enzymes métaboliques impliquées dans la biosynthèse de certains acides aminés ou de bases azotées (par exemple, 20,28-30). Ces enzymes sont essentiels pour la prolifération cellulaire en l'absence de métabolites dans exogène prévues dont la synthèse des enzymes participent. Telenzymes métaboliques peuvent ainsi fonctionner comme rapporteurs basées sur la croissance de la dégradation des protéines instables à laquelle ils sont fusionnés. Les exigences génétiques pour la dégradation des protéines peuvent être aisément élucidés, puisque des mutations qui empêchent la protéolyse permettront cellules hébergeant le reporter de dégradation de se développer dans des conditions sélectives.
Un avantage de croissance est une indication indirecte qu'une mutation particulier augmente l'abondance de la protéine d'intérêt. Cependant, l'analyse biochimique directe est nécessaire pour confirmer qu'une mutation permet la croissance à travers des niveaux accrus en protéines plutôt que par des causes indirectes ou artefacts. L'effet d'une mutation sur la protéine abondance peut être confirmée par analyse western blot des niveaux de protéines à l'état stable dans les cellules qui font et ne abritent la mutation particulière. Procédé pour l'extraction rapide et efficace de protéines de levure (incubation séquentielle de cellules de levure avec de l'hydroxyde de sodium et un tampon échantillon) sous une forme adaptéepour analyse par western blot est également présenté 31. Ensemble, ces expériences faciliter l'identification rapide des régulateurs de candidats de la dégradation des protéines.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthodologie présentée ici permet la détermination rapide et confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans des cellules de levure. Ces expériences mettent en évidence l'utilité et la puissance de la levure comme modèle organisme eucaryote (plusieurs excellentes critiques de levure biologie et compilations de protocoles pour la manipulation, le stockage et la manipulation de cellules de levure (par exemple 41-44) sont disponibles pour les e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres actuels et anciens du laboratoire Rubenstein pour fournir un environnement de recherche et enthousiaste. Nous remercions Ryan T. Gibson pour l'assistance dans l'optimisation de protocole. Nous remercions Mark Hochstrasser (Université de Yale) et Dieter Wolf (Universität Stuttgart) pour les souches de levures et plasmides. Nous remercions nos lecteurs anonymes pour leur aide dans l'amélioration de la clarté et l'utilité de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse de recherche de la section de l'Université Ball State de Sigma Xi à SGW, un National Institutes of Health subvention (R15 GM111713) au DME, une bourse de recherche de Ball State University aspirent à DME, et les fonds de l'Université Ball State Bureau du prévôt et Département de biologie.
Materials
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
| 3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs |
| Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer |
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
| Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) |
Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
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