増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em>サッカロマイセス·セレビシエ</em
Summary
This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.
Abstract
安定化されたタンパク質分解は、事実上すべての細胞機能のために重要である。真核生物のタンパク質分解のための分子機構と遺伝的要件について知られていることの多くは、最初は出芽酵母に設立されました。タンパク質分解の古典の分析は、生化学的なパルスチェイスとシクロヘキシミドチェイスの方法論に依存してきた。これらの技術は、タンパク質の分解を観察するための高感度の方法を提供するが、それらは、面倒で時間がかかり、低スループットである。これらのアプローチは、タンパク質の分解を防ぐ変異についての迅速なまたは大規模なスクリーニングに適していない。ここでは、タンパク質分解のための遺伝的要件の容易な同定のための酵母の増殖に基づくアッセイが記載されている。このアッセイでは、特定の選択条件下で増殖に必要なレポーター酵素は不安定なタンパク質に融合される。細胞の内因性レポーター酵素を欠いているが、融合タンパク質を発現するセレ下で成長することができ融合タンパク質が安定化されるだけctive条件（ すなわちタンパク質分解が損なわれている場合）。ここに記載の増殖アッセイにおいて、野生型および融合タンパク質をコードするプラスミドを有する変異体酵母細胞の段階希釈物を選択的および非選択培地上にスポットされる。選択条件下で成長が所定の変異による分解障害と一致する。増加したタンパク質存在量は、生化学的に確認すべきである。電気泳動及びウエスタンブロッティングに適した形態の酵母タンパク質の迅速な抽出のための方法も示されている。生化学分析のためのタンパク質抽出のための単純なプロトコルと組み合わせたタンパク質の安定性のための成長ベースの読み出しは、タンパク質分解のための遺伝的要件の迅速な同定を容易にします。これらの技術は、短命の種々のタンパク質の分解を監視するように適合させることができる。示した例では、ヒスチジン生合成に必要とされるのHis3酵素は、融合したそれが異常に小胞体トランスロコンに係合後にDeg1に-Sec62。Deg1 -Sec62は分解の標的とされている。 Deg1 -Sec62-のHis3を保有する細胞は、タンパク質が安定した時に選択的条件下で増殖することができた。
Introduction
選択的なタンパク質分解は、真核生物の生活のために不可欠であり、変化したタンパク質分解は、数種類の癌、神経変性疾患、心血管疾患、および嚢胞性線維症1-5を含む医学的状態の数に寄与する。選択的なタンパク質分解を触媒するユビキチン-プロテアソーム系（UPS）は、これらの条件6-10のための新たな治療標的である。ユビキチンリガーゼは共有結合したタンパク質11に76アミノ酸ユビキチンのポリマーを添付してください。ポリユビキチン鎖でマークされたタンパク質は、12プロテアソーム 〜2.5メガダルトン26Sによって認識され、タンパク質分解されている。モデル真核生物サッカロミセス·セレビシエ （出芽酵母）で開始研究は、真核細胞におけるタンパク質分解メカニズムの解明における基礎となっている。 UPSの最初の実証生理的基質は、酵母転写抑制因子MATα213だった、UPSの14、および多くの高度に保存されたコンポーネントは、最初に同定されたか（ 例えば 15-26）酵母特徴。この汎用性と遺伝的に扱いやすいモデル生物で行われた発見は、ユビキチン媒介分解の保存されたメカニズムに重要な洞察を提供し続ける可能性が高い。
認識とほとんどのUPSの基質の分解は、複数のタンパク質の協調行動が必要です。したがって、与えられた不安定なタンパク質の調節された劣化を特徴付ける重要な目標は、タンパク質分解のための遺伝的要件を決定することです。哺乳動物または酵母細胞におけるタンパク質分解を監視するための古典的なアプローチ（ 例えば 、パルスチェイスとシクロヘキシミドチェイス実験27）は、面倒で時間がかかる。方法のこれらのタイプのタンパク質分解を検出するための高感度の手段を提供するが、それらは、タンパク質分解または大規模screeniの迅速な分析には適していないタンパク質分解を防ぐ突然変異についてngの。ここでは、不安定なタンパク質の分解のための遺伝的要件の迅速な同定のための酵母増殖に基づくアッセイが提示されている。
タンパク質分解を分析するための酵母の増殖に基づく方法では、対象（または劣化信号）の不安定なタンパク質は、特定の状況下での酵母の増殖に必要とされるタンパク質を、インフレームで融合されている。結果は、関心のある不安定なタンパク質のタンパク質分解の遺伝的要件を決定するための強力なツールとして機能することができる人工的な基質である。好都合なことに、最も一般的に使用される実験室酵母株は、特定のアミノ酸または窒素含有塩基（ 例えば、20,28-30）の生合成に関与する代謝酵素をコードする遺伝子における変異のパネルを保有する。これらの酵素は、合成酵素が参加する中で、外因的に提供代謝物の非存在下での細胞増殖のために必須である。このような代謝酵素は、従って、それらが融合されるため、不安定なタンパク質の分解のための増殖に基づくレポーターとして機能することができる。タンパク質分解を防ぐ変異が劣化レポーターを有する細胞が選択的条件下で成長することができますので、タンパク質分解のための遺伝的要件は容易に解明することができます。
増殖の利点は、特定の変異が、目的のタンパク質の存在量を増加させる間接的な指標である。しかし、直接生化学分析は、変異が増加したタンパク質のレベルを介してではなく、間接的または人為的な原因を経由して成長を可能することを確認する必要がある。タンパク質存在量における変異の効果を行い、特定の変異を保有しない細胞における定常状態タンパク質レベルのウェスタンブロット分析によって確認することができる。適した形態の酵母タンパク質（水酸化ナトリウムおよびサンプル緩衝液を用いて酵母細胞の逐次インキュベーション）の迅速かつ効率的に抽出するための方法ウェスタンブロッティングによる分析のためにも31を提示する。一緒に、これらの実験は、タンパク質分解の候補調節因子の迅速な同定を容易にする。
Protocol
タンパク質分解に欠陥候補突然変異体を同定する1.酵母増殖アッセイレポーター代謝酵素と、フレームで融合された不安定なタンパク質をコードするプラスミドを、野生型および突然変異体酵母細胞を形質転換する。 プラスミド分子を保有する細胞に対して選択的である合成に定義（SD）最小培地5ml中の形質転換体を接種する。回転、30℃で一晩インキュベートする。 各?…
Representative Results
この方法論を説明するために、のHis3酵素はモデル小胞体（ER）関連分解のカルボキシ末端に融合されている（ERAD）基板、Deg1 -Sec62（ 図2A）Deg1 -Sec62-のHis3を作成する（ 図3） 。Deg1 -Sec62はロコンとの永続的な、異常な関連付けを次のターゲットとしているERAD基質の新規クラスの創立メンバーを表し、ER膜32-34間でタンパク質を移動するため?…
Discussion
ここで紹介する方法は、迅速な決定と酵母細胞内のタンパク質分解のための遺伝的要件の生化学的に確認することができます。これらの実験は、モデル真核生物として酵母の有用性とパワーを強調（処理するための酵母生物学およびプロトコルのコンピレーションのいくつかの優れたレビューは、保管、および酵母細胞を操作する（ 例えば 41-44）生物に新たな研究者のために?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、協力的かつ熱狂的な研究環境を提供するためのルーベンラボの現在および過去のメンバーに感謝。私たちは、プロトコルの最適化の支援のためにライアンT.ギブソンに感謝。我々は、酵母株およびプラスミドのためにマークHochstrasser（エール大学）とディーター·ウルフ（シュトゥットガルト大学）を感謝。我々は、この原稿の明快さと実用性の改善に彼らの助けのために私たちの匿名の査読者に感謝。この作品は、ボール州立大学からEMR、EMRにボール州立大学ASPIRE研究賞、および資金にSGWにシグマXIのボール州立大学の章から研究賞、国立衛生研究所の助成金（R15 GM111713）によってサポートされていました学長のOfficeと生物学科。
Materials
| Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
| 3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs |
| Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer |
| Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
| Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
| New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
| New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
| Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers |
| Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
| Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) |
Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
| Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
| 1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
| Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
| SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
| Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
| Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
| Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |
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Cite This Article
Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (96), e52428, doi:10.3791/52428 (2015).