This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.
Düzenlenmiş protein yıkımı hemen hemen her hücresel fonksiyon için çok önemlidir. Moleküler mekanizmaları ve ökaryotik protein yıkımı için genetik gereksinimleri hakkında bildiklerimizin çoğu başlangıçta Saccharomyces cerevisiae kurulmuştur. Protein yıkımı Klasik analizleri biyokimyasal darbe-kovalamaca ve sikloheksimid-kovalamaca metodolojileri yararlanmıştır. Bu teknikler, protein degradasyonunu gözlemlemek için duyarlı araçlar sağlarken, zahmetli, zaman alıcı ve düşük verimlilik bulunmaktadır. Bu yaklaşımlar, protein bozulmasını önlemek mutasyonlar için hızlı veya büyük ölçekli tarama için uygun değildir. Burada, protein parçalanması için genetik gereksinimleri kolay tanımlama için bir maya gelişimi tabanlı deney tarif edilecektir. Bu testte, özgül seçici koşullar altında büyüme için gerekli bir raportör enzim kararsız bir proteine kaynaştırılır. Hücreler, endojen raportör enzim eksik olan fakat füzyon proteini sele altında büyüyebilir ifadeFüzyon proteini stabilize yalnızca ktif koşulları (örneğin, protein yıkımı uyuşmazlık olduğunda). Burada tarif edilen büyüme deneyinde, vahşi tipten ve bir füzyon proteinini kodlayan bir plazmid mutant maya hücreleri seri seyreltme seçici ve seçici olmayan ortam üzerine tespit edilir. Seçici koşullar altında büyüme, belirli bir mutasyon ile bozunma bozukluğu ile tutarlıdır. Artan protein bolluğu biyokimyasal teyit edilmelidir. Elektroforez ve Western blot için müsait bir biçimde maya proteinleri hızlı bir şekilde çıkarılması için bir yöntem olup, aynı zamanda gösterilmiştir. Biyokimyasal analizi için protein çıkarılması için basit bir protokol ile birlikte protein istikrarı için bir büyüme temelli okuma, protein parçalanması için genetik gereksinimleri hızlı belirlenmesini kolaylaştırır. Bu teknikler, kısa ömürlü bir çok protein degradasyonunu izlemek için adapte edilebilir. Verilen örnekte, histidin biyosentezi için gerekli olan His3 enzim kaynaştırıldıbu anormal endoplazmik retikulum translokon yürütmektedir sonra Deg1 için -Sec62. Deg1 -Sec62 bozulması için hedeflenmiştir. Deg1 -Sec62-HIS3 barındıran hücreler proteini kararlı hale geldiğinde, seçici koşullar altında büyüyebilir mümkün.
Seçici protein yıkımı ökaryotik yaşam için gerekli olduğunu ve değiştirilmiş protein yıkımı, çeşitli kanser tipleri, nörodejeneratif hastalıklar, kardiyovasküler hastalıklar ve sistik fibrozis 1-5 dahil olmak üzere tıbbi koşullar, bir dizi katkıda bulunur. seçici protein degradasyonunu katalize ubikitin-proteazom sistemi (UPS), bu koşullar 6-10 için gelişmekte olan bir tedavi edici hedeftir. Ubikitin ligaz kovalent proteinler 11 76-amino asit ubikitinin polimerleri takın. Poliübikütin zincirleri ile işaretlenmiş proteinler tanınan ve ~ 2.5 megadalton 26S ile 12 proteazom proteolizlenmiş edilir. Model ökaryotik organizma Saccharomyces cerevisiae (çiçek mayası) başlatılan çalışmalar ökaryotik hücrelerde protein yıkımı mekanizmaların açıklanması, temel olmuştur. UPS ilk gösterdi fizyolojik substrat MATα2 13 maya transkripsiyon represörü oldu, UPS 14 ve çok sayıda yüksek derecede korunmuş bileşenler ilk olarak tespit edilmiştir ya da (örneğin, 15-26), maya ile karakterize edilir. Bu çok yönlü ve genetik uysal model organizma yapılan Keşifler ubikuitin-aracılı bozulması korunmuş mekanizmaları önemli açılımlar sağlamaya devam etmesi muhtemeldir.
Çoğu UPS yüzeylerde tanınması ve yıkımı birden proteinlerin uyumlu eylem gerektirir. Bu nedenle, belirli bir kararsız proteinin düzenlenmiş bozulmasını karakterize önemli bir gol proteoliz genetik gereksinimlerini belirlemektir. Memeli ya da maya hücrelerinde protein degradasyonunu izlenmesi için klasik yaklaşımları (örneğin, darbe kovalayıcı ve sikloheksimid kovalayıcı deneyler, 27), zahmetli ve zaman alıcı bir iştir. Yöntem bu tür protein degradasyonunu tespit etmek için çok hassas bir araç temin ederken, protein parçalanması ya da büyük ölçekli bir screeni hızlı analizi için uygun değildirProtein bozulmasını önlemek mutasyonlar için ng. Burada, kararsız proteinlerin bozunması için genetik gereklerine hızlı tespit edilmesi için bir maya gelişimi bazlı analiz sunulmuştur.
Protein degradasyonunu, ilgi (ya da bozulma sinyali) kararsız bir protein analiz etmek için maya gelişimi dayalı yöntemde, belirli koşullar altında maya büyümesi için gerekli olan bir proteine, çerçeve içinde, birleştirilir. Sonuç ilgi kararsız proteinin protein yıkımı genetik gereksinimlerini belirlemek için güçlü bir araç olarak hizmet edebilir yapay substrat. Uygun bir şekilde, en sık kullanılan laboratuar maya cinsleri, özellikle amino asitler ya da azotlu bazların (örneğin, 20,28-30) biyosentezinde yer alan metabolik enzimleri kodlayan genlerdeki mutasyonların bir panel barındırır. Bu enzimler, sentez enzimleri katılmak dışsal olarak sağlanan metabolitlerin yokluğunda hücre proliferasyonu için gereklidir. Böylekararsız proteinlerin bozunması için büyüme bazlı muhabir bağlı oldukları bağlı oldukları gibi metabolik enzimler ve böylece işlev görebilir. proteolizini engellemek mutasyonlar bozunma raportör barındıran hücreleri seçilen şartlar altında büyümeye izin verir çünkü protein yıkımı için genetik olarak gerekli gördükleri kolaylıkla açıklanacaktır edilebilir.
Bir büyüme avantajı, belirli bir mutasyon ve ilgilenilen protein bolluğu arttırır dolaylı bir göstergesidir. Ancak, doğrudan biyokimyasal analiz mutasyon oldukça dolaylı ya da suni nedenler yoluyla daha artmış protein düzeyleri ile büyümeyi izin onaylamak için gereklidir. Protein miktarı hakkında bir mutasyonun etkisi yapabilecek ve özellikle mutasyonu olmayan hücrelerde kararlı durum proteini düzeylerinin Western blot analizleri ile teyit edilebilir. Uygun bir biçimde maya proteinleri hızlı ve etkili bir ekstraksiyon (sodyum hidroksit ve numune tampon maddesi ile maya hücrelerinin sıralı inkübasyonu) için bir yöntem olupwestern blotting ile analiz için de 31 gösterilmektedir. Birlikte, bu deneyler, protein yıkımı aday düzenleyicilerinin hızlı belirlenmesini kolaylaştırmaktadır.
Burada yer alan yöntem hızlı bir şekilde belirlenmesi ve maya hücrelerinde protein yıkımı genetik gereklerine biyokimyasal onay sağlar. Bu deneyler () (örn 41-44, taşıma, depolama ve maya hücreleri manipüle etmek için protokollerin maya biyoloji birkaç mükemmel değerlendirmeleri ve derlemeler organizmaya yeni müfettişler için mevcuttur) programı ve güç maya modeli ökaryotik organizma olarak vurgulayın. teknikler kolayca protein sınıflarının birçok degradasyonunu ve boll…
The authors have nothing to disclose.
Biz bir destekleyici ve coşkulu bir araştırma ortamı sağlamak için Rubenstein laboratuar mevcut ve eski üyeleri teşekkür ederiz. Biz protokol optimizasyonu konusunda yardım almak için Ryan T. Gibson teşekkür ederim. Biz maya suşları ve plazmidler Mark Hochstrasser (Yale Üniversitesi) ve Dieter Kurt (Universität Stuttgart) teşekkür ederim. Biz bu yazının netlik ve programı geliştirmeye yardım ettikleri için anonim yorumcular teşekkür ederiz. Bu çalışma SGW'den Sigma Xi Ball State Üniversitesi bölümünden bir araştırma ödülü tarafından desteklenen, Ball State Üniversitesi Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (R15 GM111713) EMR için, EMR bir Ball State Üniversitesi aspire araştırma ödülü ve fonlar Provost Ofisi ve Biyoloji Bölümü.
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components | Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator's laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator's laboratory. | ||
3-amino-1H-1,2,4-triazole | Fisher Scientific | AC264571000 | Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs |
Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus) | Roche | 11088726001 | May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer |
Disposable borosilicate glass tubes | Fisher Scientific | 14-961-32 | Available from a variety of manufacturers |
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Available from a variety of manufacturers |
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) | New Brunswick | M1053-0450 | Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension. |
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | For use with tube roller |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Available from a variety of manufacturers |
Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped | Sarstedt | 82.1581.001 | Available from a variety of manufacturers |
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μl | Gilson | F14403 | Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers |
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 μl | Gilson | F14401 | Available from a variety of manufacturers |
Plate imaging system (e.g. Gel Doc XR+ System) |
Bio-Rad | 170-8195 | A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones. |
Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place | Eppendorf | F-35-6-30 | |
15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene | Sarstedt | 62.554.205 | Available from a variety of manufacturers |
1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364120 | Available from a variety of manufacturers |
Analog Dri-Bath Heater | Fisher Scientific | 1172011AQ | Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins |
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane | Will vary by lab and application | ||
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Will vary by lab and application |
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes | Fisher Scientific | IPFL00010 | Will vary by lab and application |
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Will vary by lab and application |
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) | Life Technologies | A-21065 | Will vary by lab and application |