הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח
Summary
A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.
Abstract
There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.
Introduction
תאים חשופים לעומסים מכאניים ברקמות רבות, וגירוי מכאני זה הוכח לקדם שינויים בדפוסי ביטוי גנים, שחרור של גורמי גדילה, ציטוקינים, או שיפוץ של מטריקס ושלד תא 1-4. האותות תאיים transduced מגירויים מכאניים כאלה מתרחשים בתהליך של mechanotransduction 5-7. במערכת הנשימה, תוצאה אחת של mechanotransduction היא העלייה במינים תגובתי חמצן (ROS) 8,9 וציטוקינים פרו-דלקתי 10 בתאי אפיתל ריאה בנוכחות של מתח מתיחה מחזורי. ראיות חזקות גם מצביעות על כך שזן מתיחה מוגזם מוביל לכוון פגיעה באפיתל מכתשי, בנוסף לתגובות הביוכימיות של תאי 11-14. למרות ההתמקדות כאן היא בראש ובראשונה על התגובה של תאי ריאה לעיוות מכאנית, מסלולים הנגרמים על ידי mechanotransduction לשחק תפקיד מפתח בbasפונקצית IC של רקמות רבות בגוף האדם, ובכלל זה הסדרה טון של כלי דם 15 והפיתוח של צלחת צמיחת 16.
ההתעניינות הגוברת בmechanotransduction הביאה בפיתוח של מכשירים רבים ליישום של עומסים מכאניים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית לתאים ורקמות בתרבית. בפרט, מכשירי החלת מתח מתיחה, אשר הוא צורה נפוצה של העמסה מכאנית המנוסים על ידי רקמות, פופולריים 11,17-19. עם זאת, רב של ההתקנים הזמינים נועדו גם כbioreactor עבור יישומי הנדסת רקמות או לא תורם להדמיה בזמן אמת עם מתיחה. ככזה, יש צורך בפיתוח כלים ושיטות שיכולים לדמיין תאים ורקמות במתח כדי להקל על החקירה של מסלולים של mechanotransduction.
במסמך זה, מכשיר מתיחה מכאני במטוס תוכנן ופרוטוקולים שפותחו כדי להחיל מ 'צורות ultiple של מתח לרקמות ותאים ומאפשרים הדמיה של התגובות ביוכימיות ומכאניות בזמן אמת (איור 1 א-ד). המכשיר משתמש בשישה מלחציים מחולק באופן שווה המסודרים circumferentially לתפוס קרום גמיש וליישם, התנפחות עד רדיאלי במטוס לכ -20% (איור 1). מכשיר actuating יכול להיות ממוקם בתרבית תאי חממה לתקופה ארוכה של זמן, ואילו מנוע (איור 1 ג) ממוקם מחוץ לחממה ונשלט על ידי תוכנת קניינית הניתנת על ידי ספק המנוע. המנוע מחובר לנהג ליניארי, אשר מסתובב מצלמת פנימית, נהיגה שישה מלחציים האלונקה אחידה במתח והרפיה.
בנוסף למכשיר המכני, קרומים גמישים מותאמים אישית נוצרו מקרומים מוכנים תרבית תאים זמינים מסחרית לשימוש במערכת המכנית. קירות ואז עגולים (בקוטר של כ28 מ"מ) נעשה ומצורף בקרום גמיש, כך שתאים יכולים להיות מתורבת רק באזור זה של פרופיל מתח מתואר היטב. על מנת לקבוע אם המיקום של הקרומים האלה בתוך המכשיר actuating יספק מתח אחיד ואיזוטרופי במרכז של הקרום גמיש, ניתוח אלמנטים סופי נערך באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי (איור 1E-F). הקרום גמיש היה דגם עם תנאי גבול סימטריים וניצול כל האלמנטים מרובע לרשת. הטבעות קונצנטריות ראו בעלילת קווי המתאר של זן עיקרי מרבי שמוצגת באיור 1F לציין את חלוקת איזוטרופיים של הזן.
המתח שעבר על הקרום נמדד על ידי הקלטת תמונות של סימונים באמצעות טעינה (איור 2). איור 2 ד מראה כי מתח הקרום הממוצע שנמדד בכיוונים רדיאלי והציריים היה כ יניאריביחס למנוע מיושם סופר עד מתח ליניארי מרבי של 20%. לא היה הבדל משמעותי בין רמות המתח נמדדו במהלך התנפחות בהשוואה לאלו שנמדדו במהלך הנסיגה חזרה למצב המנוחה. בשלב הבא, התזוזה של תאים אנושיים אפיתל הסימפונות (16HBE) והגרעינים שלהם בתרבית על הקרום גמיש המותאם אישית נמדדה. גרעינים (DAPI) שכותרתו fluorescently של תאי 16HBE היו צילמו באמצעות מטרת 20X תחת מיקרוסקופ confocal, ואילו עקירת תא שלמה נמדדה עם תמונות בניגוד השלב נרשמו עם מיקרוסקופ דיגיטלי. כפי שניתן לראות באיור 3, המתח שנמדד על ידי עקירה של גרעינים היה דומה לזה שנמדד על ידי עקירה של סימונים על הקרום, עד 20% מתח ליניארי ~. זו מאשרת כי המאמץ ליישם את הקרומים הועבר לתאים חסיד. הפרוטוקולים מתארים את השימוש במכשיר המותאם אישית על מיקרוסקופ מסורתי וmicroscop כוח אטומידואר מסופק בשלבים הבאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מכשיר ייחודי להדמיה תא חי במהלך מתיחה מכאנית פותח; והמכשיר הזה היה בשימוש בפרוטוקול ללמוד mechanobiology תאי אפיתל ריאות. במחקרים ראשוניים, נמצא כי קטע שנערך אחת עורר את הייצור של סופראוקסיד המיטוכונדריה בתאי אפיתל הסימפונות. בנוסף, הוא הוכיח כי הרמות גבוהות של לחץ מכאני גר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות שFedex מכון טכנולוגי באוניברסיטת ממפיס על תמיכתם. המחברים מבקשים להודות לתלמידים של קבוצת פרויקט עיצוב הבכירה במחלקה להנדסת מכונות באוניברסיטת ממפיס (דוד באטלר, ג'קי קרטר, דומיניק קליבלנד, יעקב שפר), דניאל כהן ממחלקת אוניברסיטת ממפיס הנדסת הטכנולוגיה לשליטה מוטורית , וד"ר בן טנג והגב 'Charlean Luellen לעזרתם בתרבית תאים. עבודה זו נתמכה על ידי K01 HL120912 (ER) וR01 HL123540 (CMW).
Materials
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5×5.25×0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
References
- Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
- Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. . Comprehensive Physiology. , (2011).
- Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
- Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
- Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
- Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
- Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
- Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells – Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
- Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
- Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
- Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
- Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
- Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
- Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
- Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
- DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).
