メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング
Summary
A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.
Abstract
There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.
Introduction
細胞は、多くの組織における機械的負荷にさらされ、この機械的刺激は、遺伝子発現、増殖因子の放出、サイトカイン、または細胞外マトリックスと細胞骨格のリモデリング1-4のパターンの変化を促進することが示されています。このような機械的刺激から形質細胞内シグナルは、メカノ5-7のプロセスを経て起こります。呼吸器系では、メカノの一つの結果は、活性酸素種（ROS）の環状の引張歪みの存在下での肺上皮細胞における8,9およびプロ炎症性サイトカイン10の増加です。強力な証拠も過度の引張歪みがセル11-14の生化学的応答に加えて、肺胞上皮の損傷を導くにつながることを示唆しています。ここでの焦点は、機械的変形に肺細胞の応答に主であるが、メカノによって誘発される経路は、BASにおいて重要な役割を果たし血管緊張15の調節および成長板16の開発など、人体の多くの組織のIC機能。
メカノへの関心の高まりは、培養細胞や組織への生理学的に関連する機械的負荷の適用のための多数のデバイスの開発をもたらしました。具体的には、組織が 経験する機械的負荷の一般的な形態である引っ張り歪を適用するデバイスは、人気11,17-19あります。しかし、利用可能なデバイスの多くは、いずれかの組織工学アプリケーションのためのバイオリアクターとして設計やストレッチでリアルタイムイメージングに資するものではありません。このように、メカノの経路の調査を容易にするために、張力の細胞及び組織を視覚化することができるツールおよび方法を開発する必要があります。
ここで、面内の機械的延伸装置が設計され、プロトコルは、Mを適用するために開発されましたultiple組織への株の形態および細胞リアルタイム（ 図1A-D）における生化学的および機械的応答のイメージングを可能にします。デバイスは、可撓性膜をつかみ、約20％（ 図1B）に面内、ラジアル膨満アップを適用するために円周方向に配置された6つの等間隔のクランプを使用しています。モータ（ 図1C）がインキュベータの外 部に配置され、モータ供給業者によって提供される独自のソフトウェアによって制御される作動装置は、長期間の細胞培養インキュベーターに置くことができます。モータは、緊張と弛緩中に均一6ストレッチャクランプを駆動する、内部カムを回転させるリニアドライバに接続されています。
機械装置に加えて、カスタマイズされた柔軟な膜は、機械的なシステムで使用される市販の細胞培養準備膜から作成されました。およその直径そして円形壁（28ミリメートル）を作製し、細胞にのみ十分に記載ひずみプロフィールのこの領域中で培養することができるように、可撓性膜上に付着させました。作動装置内のこれらの膜の配置は、可撓性膜の中心部に均一で等方性の歪みを提供するかどうかを決定するために、有限要素解析は、市販のソフトウェア（ 図1E-F）を用いて行きました。フレキシブル膜は、対称境界条件でモデル化し、メッシュのすべての四角形要素を利用しました。 図1Fに示す最大主ひずみの等高線図に見られる同心リングは、歪みの等方性の分布を示しています。
膜によって受ける歪みがローディング（ 図2）を介してマーキングの画像を記録することによって測定した。 図2Dは 、半径方向及び軸方向に測定された平均膜株がほぼ直線であったことを示します適用モータに対して20％の最大線形歪みにカウントアップします。バック休止位置へ後退時に測定されたものと比較して膨張時に測定された歪みのレベルの間に有意差はなかったです。次に、カスタム可撓性膜上で培養したヒト気管支上皮細胞（16HBE）及びそれらの核の変位を測定しました。全細胞の変位は、デジタルマイクロスコープを用いて記録位相コントラスト画像を用いて測定したのに対し16HBE細胞の蛍光標識（DAPI）核は、共焦点顕微鏡下で20X対物レンズを用いて画像化しました。 図3に見られるように20％の線形歪み〜まで、核の変位によって測定ひずみは、膜上のマーキングの変位によって測定されたものと同様でした。これは、膜に加わる歪みを接着細胞に伝達されたことを確認します。従来の顕微鏡のカスタムデバイスの使用を記述プロトコルおよび原子間力microscopeは、以下のステップで提供されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
メカニカルストレッチ中に生細胞イメージングのためのユニークなデバイスを開発しました。このデバイスは、肺上皮細胞のメカノを研究するためのプロトコルで使用されました。予備研究では、単一の保持されたストレッチは、気管支上皮細胞におけるミトコンドリアのスーパーオキシド産生を刺激することが見出されました。また、機械的な歪みのレベルの増加は、肺胞上皮細胞の単層?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、彼らのサポートのためにメンフィス大学の技術のフェデックス研究所に感謝そのたいと思います。著者らは、メンフィス（デビッド·バトラー、ジャッキー·カーター、ドミニククリーブランド、ヤコブシェーファー）の大学で機械工学部門のシニア·デザイン·プロジェクトグループの学生を認めるしたい、モータ制御のための大学メンフィスの技術工学部門からのダニエル·コーン細胞培養における彼らの助けのため、博士ビンテンさんとCharlean Luellen。この作品は、K01 HL120912（ER）とR01 HL123540（CMW）によってサポートされていました。
Materials
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5×5.25×0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
References
- Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
- Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. . Comprehensive Physiology. , (2011).
- Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
- Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
- Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
- Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
- Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
- Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells – Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
- Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
- Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
- Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
- Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
- Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
- Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
- Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
- DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).
