Живых изображений сотовый процессе механической Stretch
Summary
A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.
Abstract
There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.
Introduction
Клетки подвергают механическим нагрузкам во многих тканях, и это механическое раздражение было показано, способствуют изменения в структуре экспрессии генов, выделению факторов роста, цитокинов, или ремоделирование внеклеточного матрикса и цитоскелетом 1-4. Внутриклеточные сигналы трансдуцированных от таких механических стимулов происходит через процесс механотрансдукции 5-7. В дыхательной системы, одним из результатов механотрансдукции является увеличение активных форм кислорода (АФК) 8,9 и провоспалительных цитокинов 10 в легочных эпителиальных клеток в присутствии циклического напряжения при растяжении. Убедительные доказательства также показывает, что чрезмерное напряжение при растяжении приводит к прямой травмы альвеолярного эпителия, в дополнение к биохимических реакций клеток 11-14. Хотя основное внимание здесь, в первую очередь от реакции легких клеток к механической деформации, пути, вызванные механотрансдукции играть ключевую роль в БАСФункция IC многих тканей в организме человека, в том числе в регуляции сосудистого тонуса 15 и развитие роста пластины 16.
Растущий интерес к механотрансдукции привело к разработке многочисленных устройств для применения физиологически соответствующих механических нагрузок в культивируемых клетках и тканях. В частности, устройства, применяющие деформации растяжения, которая распространенной формой механической нагрузки, испытываемой ткани, популярны 11,17-19. Тем не менее, многие из доступных устройств либо разработан как биореактор для тканевой инженерии или не способствует реального времени визуализации с натяжкой. Таким образом, существует необходимость в разработке инструментов и методов, которые могут визуализировать клеток и тканей в напряженности, чтобы облегчить расследование путей механотрансдукции.
При этом механическое растяжение устройство в плоскости была разработана и протоколы были разработаны для применения мultiple формы деформации тканей и клеток, а позволяет визуализации биохимических и механических реакций в режиме реального времени (1А-D). Устройство использует шесть равномерно расположенных зажимов, расположенных по окружности, чтобы понять гибкую мембрану и применять в плоскости, радиальной живота примерно до 20% (Фиг.1В). Исполнительный механизм может быть размещен в инкубаторе для клеточных культур в течение продолжительного периода времени, в то время как двигатель (рис 1C) расположен вне инкубатора и управляется с помощью патентованного программного обеспечения, предоставленной поставщиком двигателя. Двигатель соединен с линейным драйвером, который вращается внутренний кулачок, вождения шесть носилок зажимы равномерно напряжения и расслабления.
В дополнение к механическим устройством, индивидуальные гибкие мембраны были созданы из коммерчески доступных клеточных культур готовых мембран, которые будут использоваться в механической системе. Затем круговые стенки (диаметром около28 мм) были изготовлены и прикреплены к гибкой мембране таким образом, что клетки могут быть культивированы только в этой области хорошо описанной деформации профиля. Для того чтобы определить, является ли размещение этих мембран в исполнительное устройство обеспечит равномерное и изотропное напряжение в центре гибкой мембраны, анализ методом конечных элементов были проведены с использованием коммерчески доступного программного обеспечения (рис 1E-F). Гибкая мембрана была смоделирована с симметричными граничными условиями и с использованием всех четырехугольных элементов для сетки. Концентрические кольца видели в контурной участке максимальной главной деформации, показанной на рис 1F показывают изотропное распределение напряжения.
Штамм испытали мембраной измерялась записи изображения маркировки через нагрузки (рисунок 2). Рисунок 2D показывает, что средняя деформация мембраны измеряется в радиальных и осевых направлениях было приблизительно линейнымпо отношению к приложенному двигателя рассчитывает до максимальной линейной деформации 20%. Там не было никакого существенного различия между уровнями деформации, измеренных во время растяжения по сравнению с теми, измеряется при отводе назад в положение покоя. Далее, смещение человека бронхиальных эпителиальных клеток (16HBE) и их ядер культивируемых на заказ гибкой мембраны были измерены. Флуоресцентно меченных (DAPI) Ядра клеток 16HBE визуализируют с помощью цели 20X под конфокальной микроскопии, в то время как объем целая клетка была измерена с фазового контраста изображений, записанных с помощью цифрового микроскопа. Как видно на рисунке 3, штамм измеряется смещением ядер был таким же, измеренная по смещению маркировки на мембране, до ~ 20% линейной деформации. Это подтверждает, что применительно к деформации мембран передается на адгезивных клеток. Протоколы, описывающие применение данного пользовательского устройства на традиционном микроскопе и атомно-силовой microscopэлектронной представлены в следующих шагов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Был разработан уникальный прибор для живого изображения клеток в процессе механического участка; и это устройство используется в протоколе для изучения mechanobiology эпителиальных клеток легких. В предварительных исследований было установлено, что один проведены растяжения стимулировал …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить что Fedex технологический институт в Университете Мемфиса за их поддержку. Авторы хотели бы поблагодарить студентов старшей группы дизайн-проекта в инженерно-механический факультет в университете Мемфиса (David Butler, Джеки Картера, Доминик Кливленде, Иаков Шаффер), Даниэль Кон из отдела Университета Мемфиса инженерных технологий для управления двигателем , и д-р Бен Дэн и г-жа Charlean Luellen за помощь в клеточной культуре. Эта работа была поддержана K01 HL120912 (ER) и R01 (HL123540 CMW).
Materials
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5×5.25×0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
References
- Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
- Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. . Comprehensive Physiology. , (2011).
- Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
- Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
- Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
- Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
- Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
- Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells – Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
- Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
- Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
- Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
- Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
- Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
- Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
- Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
- DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).
