Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme
Summary
A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.
Abstract
There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.
Introduction
Hücreler, bir çok dokuda mekanik yüklere maruz kalır ve bu, mekanik uyarma gen ekspresyonu, büyüme faktörleri, sitokinler, ya da hücre dışı matrisin yeniden verildiği şekillerindeki değişiklikleri teşvik etmek ve 1-4 hücre iskeletinin gösterilmiştir. Bu tür mekanik uyarıcılara karşı hücre içi sinyallere mechanotransduction 5-7 işleminde meydana gelir. Solunum sisteminde, mechanotransduction bir sonucu, reaktif oksijen türlerinin (ROS), siklik bir çekme gücü mevcudiyetinde pulmoner epitel hücrelerinde 8,9 ve pro-inflamatuar sitokinlerin 10 artıştır. Güçlü kanıtlar ayrıca aşırı gerilim soyu hücrelerinin 11-14 biyokimyasal yanıtların yanı sıra, alveol epiteline yaralanması doğrudan yol açtığını göstermektedir. Odak Burada mekanik deformasyon akciğer hücrelerinin yanıtı esas olmasına rağmen, mechanotransduction neden yollar bas önemli bir rol oynardamar tonusu 15 düzenlenmesinde ve büyüme plağının 16 geliştirilmesi dahil olmak üzere insan vücudunda birçok dokuda, bir ic fonksiyonu.
mechanotransduction artan ilgi kültürlenmiş hücreler ve doku için fizyolojik olarak ilgili mekanik yüklerin uygulanması için çok sayıda cihazı geliştirilmesi ile sonuçlanmıştır. Özel olarak, doku tarafından yaşanan mekanik yüklenme ortak bir biçimi olan bir çekme gücü, uygulama tertibatının 11,17-19 popülerdir. Ancak, mevcut cihazların çoğu ya doku mühendisliği uygulamaları için biyoreaktör olarak tasarımlanmış veya streç ile gerçek zamanlı görüntüleme için elverişli değildir. Bu nedenle, mechanotransduction arasında yolların araştırılmasını kolaylaştırmak için gerilim hücre ve dokuları görselleştirmek araçları ve yöntemlerinin geliştirilmesi için bir ihtiyaç vardır.
Burada, bir düzlem mekanik germe cihazı tasarlanmıştır ve protokoller m uygulamak için geliştirilmiştirultiple dokulara soyunun formları ve hücreler, gerçek zaman (Şekil 1A-D), biyokimyasal ve mekanik yanıtların görüntüleme imkan verir. Cihaz, esnek bir membran kavramak ve yaklaşık% 20 (Şekil 1B) bir düzlemsel radyal distansiyon yukarı uygulamak için çevresel olarak yerleştirilmiş olan eşit aralıklı kelepçeler kullanılmaktadır. Motor (Şekil 1C) inkübatör dışına yerleştirilmiş ve motor satıcı tarafından sunulan özel yazılım tarafından kontrol edilir ise çalıştırma tertibatı, uzun bir zaman süresi için bir hücre kültürü inkübatöründe yerleştirilebilir. kas gerginliği ve gevşeme eşit altı sedye kelepçeler sürüş bir iç cam döner lineer sürücü bağlanır.
Mekanik cihaz ek olarak, özel esnek zarların mekanik bir sistemde kullanılmak üzere ticari olarak temin edilebilen hücre kültürü hazır zarlarından oluşturulmuştur. Yaklaşık bir çapı olan, dairesel sonra duvar (28 mm) yapılmıştır ve hücreler, sadece iyi tarif edilen suş profili bu bölgede kültürlenebilir böylece esnek bir zar üzerine bağlanmıştır. Harekete geçirme cihazı içinde bu membranların yerleştirilmesi, esnek bir zarın merkezinde tek tip ve izotropik streynini sağlayabilir olup olmadığını belirlemek için, sonlu eleman analizi, ticari olarak temin edilebilen yazılımı (Şekil 1E-F) kullanılarak yapıldı. Esnek zar simetrik sınır koşulları ve örgü için tüm dörtgen elemanlar kullanan ile modellenmiştir. Şekil 1F gösterilen maksimum asal zorlanma kontur arsa görülen eş halkalar zorlanma izotropik dağılımını göstermektedir.
membran tarafından hissedilen gerginlik yükleme (Şekil 2) vasıtasıyla işaretler görüntüleri kaydedilerek sürekli olarak ölçüldü. Şekil 2B, radyal ve eksenel yönde ölçülen ortalama membran soyu yaklaşık doğrusal olduğunu göstermektediruygulanan motoru ile ilgili olarak% 20 oranında bir maksimum doğrusal suşu kadar sayar. Geri dinlenme pozisyonuna geri çekilmesi sırasında ölçülen kıyasla distansiyon sırasında ölçülen gerilme düzeyleri arasında anlamlı bir fark yoktu. Daha sonra, özel bir esnek zar üzerinde kültürlenmiş insan bronşiyal epitel hücreleri (16HBE) ve bunların çekirdeklerinin değiştirme ölçüldü. Bütün hücre yer değiştirmesi, bir dijital mikroskop ile kaydedilen faz kontrast görüntüleri ile ölçüldü ise 16HBE hücrelerinin floresan etiketli (DAPI) çekirdekler, konfokal mikroskop altında bir 20x objektif kullanılarak görüntülendi. Şekil 3'te görüldüğü gibi, çekirdek yer değiştirmesi ile ölçülen gerilme, up ~% 20 lineer streyn zar üzerinde işaretlerin yer değiştirmesi ile ölçülen benzer olmuştur. Bu membranların uygulanan gerilme yapışık hücrelere iletilen olduğunu doğrulamaktadır. Geleneksel mikroskop özel cihazın kullanımını anlatan protokolleri ve atomik kuvvet mikroskopE, aşağıdaki adımlarda verilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mekanik streç sırasında canlı hücre görüntüleme için benzersiz bir cihaz geliştirildi; ve bu cihaz, akciğer epitelyal hücre mechanobiology incelemek için bir protokol kullanılmıştır. Ön çalışmalarda, tek tutulan streç bronşiyal epitel hücrelerde mitokondrial süperoksid üretimini uyardığı tespit edildi. Buna ek olarak, mekanik zorlanma artmış seviyeleri alveolar epitel hücrelerinin bir tek tabaka bütünlüğü doğrudan bozukluklara sebep olduğu gösterilmiştir.
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, desteklerinden dolayı Memphis Üniversitesi'nde Teknoloji Fedex Enstitüsü'ne teşekkür isterim. Yazarlar Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer) Üniversitesi Makine Mühendisliği Bölümü'nde kıdemli tasarım proje grubunun öğrencileri kabul etmek istiyorum, motor kontrolü için University of Memphis Mühendislik Teknolojisi bölümünden Daniel Kohn Hücre kültüründe yardım ettikleri için, Dr. Bin Teng ve Bayan Charlean Luellen. Bu eser K01 HL120912 (ER) ve R01 HL123540 (CMW) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5×5.25×0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
References
- Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
- Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. . Comprehensive Physiology. , (2011).
- Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
- Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
- Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
- Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
- Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
- Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells – Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
- Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
- Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
- Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
- Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
- Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
- Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
- Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
- DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).
