Kwantitatieve Analyse van Klimmen Defecten in een Drosophila model van neurodegeneratieve aandoeningen
Summary
We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.
Abstract
Locomotief defecten als gevolg van neurodegeneratieve aandoeningen kan een late onset symptoom van de ziekte zijn, na jaren van subklinische degeneratie, en dus de huidige therapeutische behandeling strategieën zijn niet curatief. Door het gebruik van exoom sequencing, een groeiend aantal genen geïdentificeerd die een rol spelen bij menselijke voortbeweging. Ondanks de identificatie van deze genen, is het niet bekend hoe deze genen cruciaal zijn voor normale werking loc. Daarom is een betrouwbare test, die modelorganismen gebruikt om de rol van deze genen te helderen om nieuwe targets te identificeren van therapeutisch belang, is meer dan ooit nodig. We hebben een gesensibiliseerd versie van de negatieve geotaxis test die het mogelijk maakt voor de detectie van mildere gebreken eerder en heeft de mogelijkheid om deze gebreken te evalueren in de tijd gemaakt. De test wordt uitgevoerd in een glazen maatcilinder, die is afgedicht met een was barrièrefilm. Door het verhogen van de drempel afstand te klom naar 17,5 cm en het verhogen van de duur van het experiment tot 2 min hebben we een grotere gevoeligheid bij het opsporen van milde disfuncties mobiliteit waargenomen. De test is kostenbesparend en vereist geen uitgebreide training op zeer reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Dit maakt het een uitstekende techniek voor het screenen van kandidaat-medicijnen in Drosophila mutanten met motoriek gebreken.
Introduction
Verwoestende neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, amyotrofe laterale sclerose, en erfelijke spastische paraplegie worden steeds meer erkend. Helaas zijn de meeste van deze neurodegeneratieve aandoeningen nog steeds geen behandeling. Het wijdverspreide klinische toepassing van genoom-brede, onpartijdige genetische tests zoals exoom sequencing heeft geleid tot een toenemend aantal genen spelen een rol in humane reumatische ziektes. Ondanks deze vooruitgang, de pathologische voortgang van vroeg tot laat stadium, blijft ongrijpbaar in deze aandoeningen. Drosophila biedt een met de genetische tools voor het bestuderen van gen vereiste in een gecontroleerde ruimtelijke en temporele manier. Daarnaast heeft Drosophila nuttig bij het screenen van drugs voor neurologische aandoeningen zoals Parkinson 1, Alzheimer 2, verstandelijke beperking 3,4- en 5,6 epilepsie oa bewezen. Ons doel was om een rendabele ontwikkelingen betrouwbare test die zou hoge doorvoer analyse die nog steeds gevoelig genoeg is om kleine veranderingen in de motorische prestaties op te sporen zou zijn mogelijk te maken.
Er zijn verschillende assays gebruikt om de effecten van genetische mutatie en / of milieu vast op Drosophila klimgedrag kwantificeren. Het merendeel van de testen te profiteren van de natuurlijke neiging van vliegen te beklimmen, die bekend staat als negatief geotaxis, of het klimmen test. Benzer 7 voorgesteld in 1967 dat de tegenstroom apparaat voor de studie van phototaxis ook kan worden gebruikt om gravitaxis bestuderen. Sindsdien Ganetsky 8 en vele anderen 9 -12 hebben gebouwd op de eerste test. Het principe is om een bekend aantal vliegen te plaatsen in een flesje en tik het flesje sterk tegen een hard oppervlak, waardoor de vliegen naar de bodem van de flacon te vallen. Aangezien het een aangeboren gedrag, zal de vliegen proberen te klimmen naar de top van de flacon, tegen de zwaartekracht. Deze test is kwantitatief en measures hoeveel vliegen hebben beklommen langs een marker op de flacon tijdens een toegewezen periode. Meting van de snelheid in plaats van het totale aantal vliegen klimmen is een betrouwbare parameter en getoond defecten wanneer het aantal vliegen criteria was niet significant 13.
The climbing assay is nuttig gebleken bij het bestuderen van vele neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson 14. Echter, we opgemerkt dat locomotief gebreken niet detecteerbaar kan worden op tijd waar neurodegeneratie al wordt gezien in pathologische studies 14. Aldus kan het gebruik van de traditionele test de mogelijkheid om de vroege stadia van pathogenese te bestuderen beperken. Het uiterlijk van de locomotief defecten tijdens de latere stadia van de pathologie kan een ziekte waarvan de progressie is te geavanceerd voor volledige redding weerspiegelen.
Dit brengt het probleem met de gevoeligheid van de traditionele klimmen assay. De potentiële onvermogen van de tranele klimmen assay milde loc defecten detecteren te wijten aan de hoogte waarop de vliegen moeten klimmen. De traditionele assay 15,16 meet het aantal vliegen met succes klimmen over een hoogte van 2-5 cm in 10-20 sec.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila reeds bewezen een uitstekend model van de ziekte 14 en andere neurodegeneratieve aandoeningen Parkinson 1,2 zijn. Naast de genetische gereedschap in Drosophila, is het genoom in hoge mate geconserveerde genen die betrokken zijn bij neurologische aandoeningen 19. De komst van genoomwijde genetische screening methoden (met inbegrip van exoom sequencing) is waarschijnlijk blijven een grotere lijst van kandidaat-genen geassocieerd met menselijke bewegingsstoornis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Canadian Health Research Institute (CIHR) Team Grant to Dr. Bolduc (co-PI) and Dr. Guy Rouleau (PI). We would like to thank Dr. Oksana Suchowersky, Dr. Kathryn Todd, the members of the University of Alberta fly club and Dr. Clayton Dickson for help in development of the method and statistical analysis.
Materials
| Drosophila stocks | The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet. | ||
| Video camera | Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object. | ||
| Graduated cylinder | Kimble | 20028W | Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height. |
| computer | Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point |
References
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).
- Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory. Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).
- McBride, S. M., et al. Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome. Neuron. 45, 753-764 (2005).
- Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. 유전학. 187, 523-534 (2011).
- Marley, R., Baines, R. A. Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant. Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).
- Benzer, S. Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).
- Ganetzky, B., Flanagan, J. R. On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster. Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait. Nature genetics. 31, 349-353 (2002).
- Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster. Nature protocols. 5, 20-25 (2010).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Botella, J. A., et al. The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration. Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson’s disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Chakraborty, R., et al. Characterization of a Drosophila Alzheimer’s disease model: pharmacological rescue of cognitive defects. PLoS One. 6, e20799 (2011).
- Orso, G., et al. Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine. J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).
- Lehmann, E. L., D’Abrera, H. J. M. . Nonparametrics : statistical methods based on ranks. , (2006).
- Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function. PLoS biology. 2, e429 (2004).
- Inlow, J. K., Restifo, L. L. Molecular and comparative genetics of mental retardation. 유전학. 166, 835-881 (2004).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila. 유전학. 161, 1197-1208 (2002).
