We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.
פגמי קטר הנובעים מהפרעות ניווניות יכולים להיות סימפטום מאוחר של מחלה, לאחר שנים של ניוון תת-קליני, ואסטרטגיות טיפול טיפוליות וכך הנוכחיות אינן מרפאים. באמצעות השימוש ברצף exome כל, מספר גדל והולך של גנים זוהה לשחק תפקיד בתנועה אנושית. למרות זיהוי גנים אלה, זה לא ידוע כמה גנים אלה הם חיוניים לתפקוד נורמלי קטר. לכן, assay אמין, אשר מנצל אורגניזמים מודל על מנת להבהיר את תפקידם של גנים אלה כדי לזהות מטרות רומן של עניין טיפולי, יש צורך יותר מתמיד. יש לנו תוכנן גרסה רגיש של assay geotaxis השלילית המאפשר לגילוי פגמים קלים יותר מוקדם ויש לו היכולת להעריך ליקויים אלה לאורך זמן. Assay מבוצע בכוס סיים גליל, אשר חתום עם סרט מכשול שעווה. על ידי הגדלת מרחק הסף להיות טיפס ל -17.5 גמ 'ולהגדיל את משך הניסוי 2 דקות שראינו רגישות רבה יותר באיתור בעיות בתפקוד ניידות קלה. Assay הוא עלות אפקטיבי ואינו דורש הכשרה מקיפה כדי להשיג תוצאות מאוד לשחזור. זה עושה את זה טכניקה מעולה לסינון תרופות מועמד במוטציות תסיסנית עם מומי תנועה.
הפרעות ניווניות הרסניות כגון מחלת פרקינסון, טרשת לרוחב amyotrophic, וparaplegia ספסטי התורשתי מוכרות יותר ויותר. למרבה הצער, רוב ההפרעות ניווניות אלה עדיין ללא טיפולים. השימוש הקליני הנרחב ב, בדיקות גנטיות משוחדת הגנום כגון רצף exome כל הוביל למספר גדל והולך של גנים שמעורבים בהפרעות קטר אנושיות. למרות התקדמות זו, ההתקדמות פתולוגיים ממוקדם לשלבים מאוחרים, נותרת חמקמקה בהפרעות אלה. תסיסנית מספקת אחד עם הכלים הגנטיים ללימוד דרישת גן באופן מרחב ובזמן בשליטה. בנוסף, תסיסנית הוכיחה שימושית בסינון תרופות לתנאי נוירולוגיות כמו פרקינסון 1, אלצהיימר 2, נכות אינטלקטואליות 3,4 ואפילפסיה 5,6 בין יתר. המטרה שלנו הייתה לפתח חסכוניוassay אמין שיאפשר ניתוח תפוקה גבוה שעדיין יהיה רגיש מספיק כדי לזהות שינויים קטנים בביצועי מנוע.
ישנם מספר מבחני המשמשים לכמת את ההשפעות של מוטציה גנטית ו / או תנאי סביבה על תסיסנית טיפוס התנהגות. רוב מבחני לנצל את הנטייה הטבעית של זבובים לטפס, הידוע בשם geotaxis השלילית, או assay הטיפוס. 7 Benzer הציע בשנת 1967 כי המנגנון נגד זרם המשמש למחקר של Phototaxis יכול לשמש גם כדי ללמוד gravitaxis. מאז, Ganetsky 8 ועוד רבים אחרים 9 -12 שנבנו על assay הראשוני. העיקרון הוא למקם מספר ידוע של זבובים בבקבוקון ולהקיש על הבקבוקון בחריפות נגד משטח קשה, גורם לזבובים ליפול לתחתית של הבקבוקון. כפי שהוא התנהגות מולדת, הזבובים ינסו לטפס לחלק העליון של הבקבוקון, בניגוד לכוח המשיכה. assay זה הוא כמותי וmeasuמיל כמה זבובים טיפס עבר סמן על הבקבוקון במהלך תקופת זמן מוקצב. מדידה של מהירות במקום מספר הכולל של טיפוס זבובים הפכה פרמטר אמין ולראות פגמים במקרים בהם מספר קריטריוני זבובים לא היה משמעותי 13.
Assay הטיפוס הוכיח שימושי בחקר הפרעות ניווניות רבות, כולל מחלת פרקינסון 14. עם זאת, ציינו כי ליקויי קטר לא יכולים להיות לזיהוי בזמן שבו ניוון של מערכת עצבים נראים כבר במחקרים פתולוגיים 14. לפיכך, שימוש של assay המסורתי עלול להגביל את היכולת ללמוד המוקדמים של היווצרות מחלה בשלבים. המראה של פגמי קטר בשלבים מאוחר יותר של פתולוגיה עשוי לשקף מחלה ההתקדמות שלו הוא מתקדם מדי להצלה שלמה.
זה מעלה בעיה פוטנציאלית עם הרגישות של assay הטיפוס המסורתי. חוסר היכולת הפוטנציאלית של tradiניתן לייחס tional טיפוס assay כדי לזהות פגמי קטר קלים עד הגובה שאליו הזבובים נדרשים לטפס. Assay 15,16 האמצעים המסורתיים מספר הזבובים לטפס בהצלחה מעל לגובה של 2 עד 5 סנטימטר ב 10 עד 20 שניות.
תסיסנית כבר הוכיחה להיות מודל מצוין ב1,2 המחלה 14 ותנאים ניווניות אחרים של פרקינסון. בנוסף לכלים הגנטיים הזמינים בדרוזופילה, הגנום שלו הוא שמור ביותר לגנים מעורבים בהפרעות נוירולוגיות 19. כניסתו של שיטות הגנום רחבות סינון גנטי (כוללים רצף exome…
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by a Canadian Health Research Institute (CIHR) Team Grant to Dr. Bolduc (co-PI) and Dr. Guy Rouleau (PI). We would like to thank Dr. Oksana Suchowersky, Dr. Kathryn Todd, the members of the University of Alberta fly club and Dr. Clayton Dickson for help in development of the method and statistical analysis.
Drosophila stocks | The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet. | ||
Video camera | Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object. | ||
Graduated cylinder | Kimble | 20028W | Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height. |
computer | Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point |