Analisi quantitativa dei difetti arrampicata in un modello Drosophila di malattie neurodegenerative

Summary

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

Abstract

Difetti Locomotive derivanti da malattie neurodegenerative possono essere un sintomo di esordio tardivo della malattia, dopo anni di degenerazione subclinica, e quindi attuali strategie di trattamento terapeutico non sono curativi. Attraverso l'uso di sequenziamento exome, un numero crescente di geni sono stati identificati per giocare un ruolo nella locomozione umana. Nonostante l'identificazione di questi geni, non è noto come questi geni sono essenziali al funzionamento normale locomotiva. Pertanto, un test affidabile, che utilizza organismi modello per chiarire il ruolo di questi geni per identificare nuovi bersagli di interesse terapeutico, è necessaria più che mai. Abbiamo progettato una versione sensibilizzata del test geotassi negativi che consente il rilevamento di difetti lievi anteriore e ha la capacità di valutare questi difetti nel tempo. Il saggio viene eseguito in un cilindro graduato in vetro, che è sigillato con un film barriera di cera. Aumentando la distanza limite ad essere scalata a 17,5 cm ed aumentando la durata dell'esperimento per 2 min abbiamo osservato una maggiore sensibilità nella rilevazione disfunzioni mobilità lievi. Il test è conveniente e non richiede una formazione completa per ottenere risultati altamente riproducibili. Questo lo rende una tecnica eccellente per lo screening candidati farmaci in mutanti di Drosophila con difetti di locomozione.

Introduction

Malattie neurodegenerative devastanti come il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica, e paraplegia spastica ereditaria sono sempre più riconosciuti. Sfortunatamente, la maggior parte di questi disturbi neurodegenerativi sono ancora senza trattamenti. L'uso clinico diffuso di test genetici, imparziali genoma come il sequenziamento dell'esoma ha portato ad un numero sempre maggiore di geni di essere coinvolto in disturbi locomotiva umani. Nonostante questi progressi, la progressione patologica dalla mattina presto alla fase avanzata, rimane inafferrabile in questi disturbi. Drosophila fornisce uno con gli strumenti genetici per lo studio requisito gene in modo spaziale e temporale controllato. Inoltre, Drosophila è dimostrato utile nello screening farmaci per malattie neurologiche come il Parkinson ^1, il morbo di Alzheimer ^2, ritardo mentale ed epilessia ^{3,4 5,6} tra gli altri. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un costo effettivoe il dosaggio affidabile che permetta di alta analisi rendimento che sarebbe ancora abbastanza sensibile per rilevare piccole variazioni nelle prestazioni del motore.

Ci sono diversi test utilizzati per quantificare gli effetti di mutazione genetica e / o le condizioni ambientali sul comportamento arrampicata Drosophila. La maggior parte dei saggi capitalizzare la naturale tendenza di mosche da scalare, noti come geotassi negativi, o il saggio arrampicata. Benzer ⁷ suggerito nel 1967 che l'apparato controcorrente utilizzato per lo studio di fototassi potrebbe anche essere usato per studiare gravitaxis. Da allora, Ganetsky ⁸ e molti altri ^{9 -12} hanno costruito sul dosaggio iniziale. Il principio è quello di mettere un numero noto di mosche in una fiala e toccare la fiala fortemente contro una superficie dura, causando linea a cadere sul fondo della fiala. Dato che è un comportamento innato, linea tenteranno di salire fino alla cima del flaconcino, al contrario di gravità. Questo test è quantitativa e measures quanti mosche sono saliti oltre un marcatore sul flacone nel corso di un periodo di tempo assegnato. Misurazione della velocità invece del numero totale di mosche arrampicata è diventata un parametro affidabile e mostrato difetti nei casi in cui il numero dei criteri mosche non era significativo ^13.

Il dosaggio arrampicata è dimostrata utile nello studio di molte malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson ^14. Tuttavia, abbiamo notato che i difetti locomotiva non deve essere rilevabile al momento in cui la neurodegenerazione è già visto in studi patologici ^14. Pertanto, l'uso del test tradizionale può limitare la capacità di studiare le prime fasi della patogenesi della malattia. La comparsa di difetti locomotiva durante le fasi successive di patologia può riflettere una malattia la cui progressione è troppo avanzato per la completa salvataggio.

Ciò solleva un potenziale problema con la sensibilità del tradizionale test arrampicata. Il potenziale incapacità del tradizionale arrampicata test di rilevare difetti locomotiva lievi può essere attribuito alla quota alla quale linea devono salire. Le tradizionali misure assay ^15,16 il numero di mosche a salire con successo su un'altezza di 2 a 5 cm di 10 a 20 sec.

Protocol

La ricerca sulle Drosophila melanogaster era conforme con l'Università di linee di ricerca di Alberta. 1. Fly Collection Raccogliere 20 mosche con CO 2 (g), anestesia e posto in una fiala di raccolta 25 millimetri x 95 millimetri contenente cibo. Fiale magazzini contenenti mosche orizzontalmente per evitare di intrappolare le mosche in liquidi che possono accumularsi sul fondo della fiala. Incubare mosche per almeno 21 ore a 22 ° C a 4…

Representative Results

L'arrampicata è un comportamento forte e riproducibile. Infatti, un giorno di vita in linea wild-type di raggiungere le prestazioni arrampicata distanza del bersaglio in rapido (25 – 30 sec). Mosche mutanti presentano una serie di prestazioni da lieve (o ritardato) per completare l'incapacità di salire al bersaglio. Illustriamo questo qui con due diversi alleli mutanti. Il primo è una grave allele del gene spastin causata da una delezione completa del gene spastin (terme 5,75) 18. In questa linea (…

Discussion

Drosophila ha già dimostrato di essere un ottimo modello di malattia ¹⁴ e altre malattie neurodegenerative ^1,2 di Parkinson. Oltre agli strumenti genetici disponibili in Drosophila, suo genoma è altamente conservata per geni coinvolti nei disordini neurologici ^19. L'avvento di ampi metodi di screening genetico genoma (compresi sequenziamento dell'intero esoma) è probabile che continuerà a fornire una più grande lista di geni candidati associati con disturbi…

Materials

Drosophila stocks			The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet.
Video camera			Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object.
Graduated cylinder	Kimble	20028W	Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height.
computer			Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point