神経変性疾患のショウジョウバエモデルにおけるクライミング欠陥の定量分析
Summary
We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.
Abstract
神経変性疾患に起因する機関車の欠陥は、無症候性変性の年後に、疾患の遅発性の症状であることができ、したがって、現在の治療の治療戦略は治癒的ではありません。全体exomeシーケンスを使用することにより、遺伝子の増加は、ヒトの移動において役割を果たすことが同定されています。これらの遺伝子の同定にもかかわらず、これらの遺伝子は、正常な機関車の機能に重要であるかは知られていません。そのため、治療目的の新規標的を同定するために、これらの遺伝子の役割を解明するためのモデル生物を利用し信頼性の高いアッセイは、これまで以上に必要とされています。我々は以前より穏やかな欠陥の検出を可能にし、時間をかけてこれらの欠陥を評価する能力を有する負の走地性アッセイの感作されたバージョンを設計しました。ガラス中で行われるアッセイは、ワックスバリアフィルムで封止されているシリンダー、メス。閾値距離を増加させることによって、17.5℃に上昇させます私たちは穏やかなモビリティ機能障害を検出するのに高い感度を観察している2分の実験期間をMと増加。アッセイは、費用対効果がされており、再現性の高い結果を得るために広範囲の訓練を必要としません。これは、運動欠陥のショウジョウバエの変異体では、候補薬剤をスクリーニングするための優れた手法になります。
Introduction
パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、および遺伝性痙性対麻痺のような壊滅的な神経変性疾患は、ますます認識されています。残念ながら、これらの神経変性疾患のほとんどは、治療せずに残っています。このような全体exomeシーケンシングなどのゲノムワイドな、公平な遺伝子検査の広範な臨床使用は、ヒト機関車の障害に関与している遺伝子の数の増加につながっています。この進歩にもかかわらず、初期後期への病理学的進行は、これらの疾患でとらえどころのないままになります。 ショウジョウバエは、制御された空間及び時間的に遺伝子の要件を研究するための遺伝的ツールとのうちの1つを提供します。また、 ショウジョウバエは、パーキンソン1、アルツハイマー2、知的障害3,4およびとりわけてんかん5,6などの神経学的状態のための薬剤のスクリーニングに有用であることが証明されました。私たちの目的は、効果的なコストを開発することでしたまだモータ性能の小さな変化を検出するのに十分な感度であろう、高スループット分析を可能にする信頼性の高いアッセイ。
ショウジョウバエクライミング挙動に関する遺伝子変異及び/又は環境条件の影響を定量化するために使用されるいくつかのアッセイがあります。アッセイのほとんどは負の走地性、またはクライミングアッセイとして知られて登るハエの自然な傾向を生かします。 Benzer 7は走光性の研究のために使用されるカウンター現在の装置はまた、重力走性を研究するために使用することができることを1967年に提案しました。それ以来、Ganetsky 8および他の多くの9 -12は最初のアッセイ上に構築されてきました。原理は、バイアルにハエの既知の数を配置し、ハエがバイアルの底に落下させ、硬い表面に対して強くバイアルをタップすることです。それは生得的行動であるように、ハエは、重力に反対し、バイアルの上部に登るしようとします。このアッセイは、定量的およびmeasuです割り当てられた時間期間の間に、バイアル上のマーカーを越えて上昇しているどのように多くのハエのres。代わりにハエクライミングの総数の速度の測定は、信頼性の高いパラメータとなり、ハエの基準の数は13に有意ではなかった場合の欠陥を示しています。
クライミングアッセイは、パーキンソン病14を含む多くの神経変性疾患の研究に有用であることが証明されました。しかし、我々は、機関車の欠陥は、神経変性が既に病理学的研究14に見られる時に検出されない場合があることに留意しました。したがって、従来のアッセイの使用は、疾患の発症の初期段階を研究するための能力を制限することができます。病理学の後の段階の間に機関車の欠陥の外観は、その進行の完全な救済のためのあまりに高度である疾患を反映することができます。
これは、従来のクライミングアッセイの感度を持つ潜在的な問題を提起します。 tradiの潜在的なことができないこと軽度の機関車の欠陥を検出するため的なクライミングアッセイはハエを登るために必要とされた高さに帰することができます。正常に10〜20秒で2〜5センチメートルの高さを乗り越えるために、従来のアッセイ15,16対策ハエの数。
Protocol
Representative Results
Discussion
ショウジョウバエはすでにパーキンソン病14および他の神経変性条件1,2に優れたモデルであることが証明されました。 ショウジョウバエで利用可能な遺伝子ツールに加えて、そのゲノムは非常に神経疾患19に関与する遺伝子のために保存されています。 （全体exomeシーケンシングを含む）ゲノムワイド遺伝子スクリーニング法の出現は、人間の運動障害?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a Canadian Health Research Institute (CIHR) Team Grant to Dr. Bolduc (co-PI) and Dr. Guy Rouleau (PI). We would like to thank Dr. Oksana Suchowersky, Dr. Kathryn Todd, the members of the University of Alberta fly club and Dr. Clayton Dickson for help in development of the method and statistical analysis.
Materials
| Drosophila stocks | The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet. | ||
| Video camera | Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object. | ||
| Graduated cylinder | Kimble | 20028W | Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height. |
| computer | Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point |
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