Een Geoptimaliseerd Verrijking Techniek voor de isolatie van<em> Arthrobacter</em> Bacteriophage Soorten uit Soil Sample Isoleert

Summary

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Abstract

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

Introduction

De alomtegenwoordigheid van Arthrobacter soorten in de bodem omgevingen en biedt een groot aantal en de diversiteit van fagen kunnen worden geïsoleerd van deze soort van gastheer bacteriën. Bacteriële leden van de familie Acintobacteriaceae zijn het meest bekend om hun katabole paden van vernederende recalcitrante verbindingen zoals atrazine en diverse andere pesticiden en herbiciden ^1,2,3. Hoewel de meeste onderzoek is gedaan met behulp van het milieu stammen van Arthrobacter, wordt klinische isolaten van deze soort gevonden in bloed, urine, ogen, en vele andere menselijke bronnen die allemaal van fylogenetische heterogeniteit ^4.

Hoewel er een vrij uitgebreid lichaam van het onderzoek op Arthrobacter bacteriën, slechts een paar studies rapporteren over de fagen kunnen infecteren leden van deze diverse geslacht. Interessant is echter, werk eerder gedaan op Arthrobacter fagen hand gelegd aan een aantal belangrijke verschillende onderwerpen, zoals de typering van de bodem <em> Arthrobacter species ^5, industrieel gebruik met het oog op het verminderen van schadelijke schuim in actief slib zuiveringsinstallaties ^6, en werk benadrukken locatiespecifieke recombinatie en integrase genen ^7.

Verschillende verrijkingstechniek protocollen zijn gebruikt voor het genereren zuivere faag isolaten Arthrobacter species. Vroege procedures omvatten incubaties van de bodem met toegevoegde giftige stoffen zoals nicotine zouten voor een periode van meer dan één jaar ⁸ die aanleiding geven tot fagen staat alleen infecteren A. globiformis. Studies gedaan met behulp van de bodem gepercoleerd met labiele organische bleek detecteerbare fagen te produceren via plaque assay technieken, met weglating van lange incubatietijd ^8. Interessant is echter, een techniek lijkt rechtstreeks plateren werd in het verleden gebruikt die tot verschillende fagen terwijl nog steeds een opmerkelijk lage slagingspercentage van de onderzoekers ^5, citeren eerdere studies met lage succespercentages <sup> 8.

Kortom, de isolatietechnieken die in het verleden waren opmerkelijk voor die weinig werkzaamheid in de praktijk, ondanks het geslacht Arthrobacter die de meest voorkomende aerobe bodem isoleren natuur ^4,9, Van Twest en Kropinski ¹⁰ verrijking onderhavige werkwijzen voor het isoleren van fagen van water en grond aangepast van eerdere technieken gebruikt om het milieu bacteriële isolaten maar deze verrijking technieken verrijken inefficiënt gebleken in het isoleren van Arthrobacter fagen. Het doel van de hier beschreven werkwijze verlangde "proof of concept" dat de vroege verrijking werkwijzen kunnen worden aangepast om consistent en effectief te isoleren Arthrobacter fagen overwinnen voorafgaande technische uitdagingen van fagen isoleren van deze bacteriële genus.

Protocol

1. Bereiding van Arthobacter Cellen voor Phage Isolatie Cultuur Arthrobacter sp. KY3901 kolonies uitgestreken op Luria Bertaini (LB) agar plaat geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen. Kies een kolonie en een steriele lus toe te voegen aan 250 ml LB-bouillon in een baffled cultuur kolf en geïncubeerd in een incubator schudden bij 225 rpm bij 30 ° C. Laat ongeveer 24 uur van de groei van de laat-exponentiële / vroeg-stationaire cellen voor faaginfectie experimenten te verkri…

Representative Results

Om de reproduceerbaarheid van de verbeterde verrijking techniek voor Arthrobacter fagen te tonen, werden 30 verschillende grondmonsters gebruikt op verschillende tijdstippen en locaties tijdens de lente en zomer van 2014. Van deze 30 grondmonsters unieke Arthrobacter fagen werden verkregen uit 22 van verzamelde grondmonsters met behulp van deze verrijking procedure. De standaard verrijkingsprocedure leverde unieke fagen van 3 van dezelfde bodemmonsters. De verrijking monsters kunnen een faag titer hoog…

Discussion

Ondanks vele eerdere pogingen om fagen kunnen infecteren Arthrobacter gastheren isoleren, we hadden weinig succes met behulp van standaard verrijking procedures. De algemene werkwijze van bacteriële verrijking ontwikkeld en aangepast door van Twest en Kropinski ¹⁰ fagen verrijken van milieumonsters blijft de basis voor de meeste verrijking procedures. Bewijs uit eerdere studies blijkt dat methoden van directe plating detecteerbaar plaques op stammen van Arthrobacter hebben geproduceerd, zij…

Materials

LB Broth powder	Fisher	BP9722-2	It's best to order these in bulk.
Granulated Agar	Fisher	BP1423-2	It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters	Fisher	09-719A
.22 um buchner filters	Fisher	430320	More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes	Fisher	05-408-129
5 mL pipets individual	Fisher	13-678-11D
50 mL conical tubes	Fisher	76002844
15 mL conical tubes	Fisher	76002845
10 mL pipets individual	Fisher	13-676-10J
25 mL pipets individual	Fisher	13-676-10K
Whatman qualitative filter paper	Fisher	1001-824