Uma técnica de enriquecimento Aperfeiçoado para o isolamento de<em> Arthrobacter</em> Bacteriophage Espécie de amostra de solo Isolados
Summary
We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.
Abstract
Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.
Introduction
A onipresença de espécies Arthrobacter em ambientes de solo oferece um vasto número e diversidade de fagos capazes de serem isolados nessa espécie de bactérias hospedeiras. Bacterianas membros da família Acintobacteriaceae são o mais notável para suas vias catabólicas de degradar compostos recalcitrantes como atrazina e vários outros pesticidas e herbicidas 1,2,3. Embora a maioria das pesquisas tem sido feito utilizando estirpes ambientais de Arthrobacter, isolados clínicos deste gênero é encontrado no sangue, urina, olhos, e muitas outras fontes humanas todos exibindo heterogeneidade filogenética 4.
Enquanto não há um corpo bastante extensa pesquisa sobre bactérias Arthrobacter, apenas alguns estudos relatam sobre os fagos capazes de infectar membros deste gênero diverso. Curiosamente, porém, o trabalho feito anteriormente em Arthrobacter fagos toques sobre diversos temas distintos-chave, tais como a digitação de solo <em> espécies Arthrobacter 5, usos industriais, com o objetivo de reduzir espuma deletéria em estações de tratamento de lamas activadas 6, e destacando o trabalho de recombinação sítio específico e genes integrase 7.
Vários protocolos técnica de enriquecimento têm sido empregadas para gerar pura fago isolados em espécies Arthrobacter. Procedimentos iniciais incluem incubações de solo com agentes tóxicos adicionais como sais de nicotina por períodos de mais de um ano 8 dando origem a fagos capazes de infectar apenas A. globiformis. Estudos feitos usando solo percolados com orgânicos instáveis apareceu para produzir fagos detectáveis através de técnicas de ensaio de placa, omitindo períodos de incubação longos 8. Curiosamente, porém, uma técnica parecida com semeadura direta foi utilizado no passado dando origem a vários fagos enquanto continua a ter uma baixa taxa de sucesso nomeadamente pelos investigadores 5, citando estudos anteriores com baixas taxas de sucesso <saté> 8.
No geral, as técnicas de isolamento usados no passado eram notável por ter pouca eficácia na prática, apesar das género Arthrobacter representativas do solo aeróbico mais comum isolar na natureza 4,9,, Van Twest e Kropinski 10 atuais métodos de enriquecimento para isolamento de fagos a partir da água e do solo adaptado a partir de técnicas anteriores utilizadas para enriquecer isolados bacterianos ambientais, mas estas técnicas de enriquecimento se mostrou ineficiente para isolar fagos Arthrobacter. O objectivo do método descrito aqui é mostrar "prova de conceito" que os métodos de enriquecimento precoces podem ser adaptados de forma consistente e eficaz isolar fagos Arthrobacter, ultrapassar os desafios técnicos anteriores, associados com o isolamento de fagos a partir deste género bacteriano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apesar de muitas tentativas anteriores para isolar fagos capazes de infectar hospedeiros Arthrobacter, tivemos pouco sucesso utilizando procedimentos de enriquecimento padrão. O método de enriquecimento bacteriana generalizada desenvolvido e adaptado por van Twest e Kropinski 10 para enriquecer os fagos a partir de amostras ambientais continuam a base para a maioria dos procedimentos de enriquecimento. Evidências de estudos anteriores sugerem que métodos de plaqueamento direto produziram placas d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O financiamento para o desenvolvimento deste protocolo foi fornecido pela Pennsylvania Consortium Sudeste do Ensino Superior e do Departamento de Ciência Cabrini College. Financiamento e apoio adicional veio da Universidade de Arcadia e Universidade Imaculada. Agradecemos especialmente ao Dr. Karen Snetselaar em St. Joseph Universidade para gentilmente tomando as imagens microscópicas de elétrons dos nossos fagos isoladas. Apoio adicional foi fornecido pelos Hunters Instituto Médico Howard Hughes Educação Ciência Alliance fagos Avançando Genomics e Evolutiva Ciência programa (SEA-fagos).
Materials
| LB Broth powder | Fisher | BP9722-2 | It's best to order these in bulk. |
| Granulated Agar | Fisher | BP1423-2 | It's best to order these in bulk. |
| 0.22 um syringe filters | Fisher | 09-719A | |
| .22 um buchner filters | Fisher | 430320 | More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube. |
| Eppendorf Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 5 mL pipets individual | Fisher | 13-678-11D | |
| 50 mL conical tubes | Fisher | 76002844 | |
| 15 mL conical tubes | Fisher | 76002845 | |
| 10 mL pipets individual | Fisher | 13-676-10J | |
| 25 mL pipets individual | Fisher | 13-676-10K | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher | 1001-824 |
References
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