Une technique d'enrichissement Optimisé pour l'isolement de<em> Arthrobacter</em> Bactériophage Espèces de l'échantillon du sol Isole

Summary

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Abstract

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

Introduction

L'omniprésence des espèces Arthrobacter dans des environnements de sol offre un grand nombre et la diversité des phages susceptibles d'être isolé de cette espèce de bactéries hôtes. Bactériennes membres de la famille Acintobacteriaceae sont les plus notables pour leurs voies cataboliques de dégrader des composés récalcitrants comme l'atrazine et d'autres pesticides et herbicides ^1,2,3. Bien que la plupart des recherches ont été faites en utilisant des souches environnementales de Arthrobacter, isolats cliniques de ce genre se trouve dans le sang, l'urine, les yeux, et de nombreuses autres sources humaines tout une hétérogénéité phylogénétique ^4.

Bien qu'il existe un corps plutôt vaste de la recherche sur les bactéries Arthrobacter, seules quelques études signalent sur ​​les phages capables d'infecter les membres de ce genre diversifié. Fait intéressant cependant, le travail fait précédemment sur ​​Arthrobacter phages touches sur plusieurs sujets distincts clés tels que le typage du sol <em> espèces Arthrobacter ^5, les utilisations industrielles dans le but de réduire la mousse délétère dans les usines de traitement des boues activées ^6, et le travail en soulignant recombinaison spécifique de site et les gènes de l'intégrase ^7.

Divers protocoles de technique d'enrichissement ont été employées pour générer des isolats de phage pur dans les espèces Arthrobacter. Les premières procédures comprennent incubations de sol avec des agents toxiques ajoutés comme les sels de nicotine pour des périodes de plus d'un an donnant lieu à ⁸ phages capables de ne infecter A. globiformis. Des études effectuées en utilisant le sol percole avec des matières organiques labiles semblent produire des phages détectables par des techniques d'analyse plaque, en omettant longues périodes d'incubation ^8. Fait intéressant cependant, une technique qui ressemble à ensemencement direct a été utilisé dans le passé donnant lieu à plusieurs phages tout en ayant un taux de réussite particulièrement faible par les enquêteurs ^5, citant des études passées avec faibles taux de réussite <sjusqu'à> 8.

Dans l'ensemble, les techniques d'isolation utilisés dans le passé ont été remarquables pour avoir peu d'efficacité dans la pratique malgré les genre Arthrobacter représentant le sol aérobie la plus courante isoler dans la nature ^4,9, Van Twest et Kropinski ¹⁰ méthodes d'enrichissement présents pour isoler les phages de l'eau et du sol adapté de techniques antérieures utilisées pour enrichir isolats bactériens environnementaux, mais ces techniques d'enrichissement se est avéré inefficace à isoler phages Arthrobacter. Le but de la méthode décrite ici est de montrer "preuve de concept" que les méthodes d'enrichissement début peuvent être adaptés pour isoler cohérente et efficace phages Arthrobacter, surmonter les défis techniques associés à isoler précédentes phages de ce genre bactérien.

Protocol

1. Préparation des cellules pour Arthobacter Phage Isolement Culture Arthrobacter sp. KY3901 colonies striées sur une Luria Bertaini (LB) plaque de gélose incubées à 30 ° C pendant 2-3 jours. Choisissez une colonie et utiliser une boucle stérile pour l'ajouter à 250 ml de bouillon LB dans un flacon de culture perplexe et incuber dans un incubateur sous agitation à 225 tours par minute à 30 ° C. Laisser environ 24 h de la croissance pour obtenir fin des cellu…

Representative Results

Pour démontrer la reproductibilité de la technique d'enrichissement amélioré pour phages Arthrobacter, 30 échantillons de sol différents ont été utilisés à différents moments et les lieux au cours du printemps et de l'été 2014. Parmi ces échantillons 30 de sol phages Arthrobacter uniques ont été obtenus à partir de 22 échantillons de sol prélevés en utilisant cet enrichissement procédure. La procédure d'enrichissement donné norme phages uniques à partir de trois de c…

Discussion

Malgré de nombreuses tentatives antérieures afin d'isoler les phages capables d'infecter des hôtes Arthrobacter, nous avons eu peu de succès en utilisant des procédures d'enrichissement standard. La méthode généralisée de l'enrichissement bactérienne développé et adapté par van Twest et Kropinski ¹⁰ pour enrichir phages partir d'échantillons environnementaux demeure la base de la majorité des procédures d'enrichissement. Les résultats d'études précédent…

Materials

LB Broth powder	Fisher	BP9722-2	It's best to order these in bulk.
Granulated Agar	Fisher	BP1423-2	It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters	Fisher	09-719A
.22 um buchner filters	Fisher	430320	More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes	Fisher	05-408-129
5 mL pipets individual	Fisher	13-678-11D
50 mL conical tubes	Fisher	76002844
15 mL conical tubes	Fisher	76002845
10 mL pipets individual	Fisher	13-676-10J
25 mL pipets individual	Fisher	13-676-10K
Whatman qualitative filter paper	Fisher	1001-824