Оптимизированная Техника по обогащению для изоляции<em> Arthrobacter</em> Бактериофаг Виды из образца почвы изолирует
Summary
We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.
Abstract
Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.
Introduction
Широкое распространение Arthrobacter видов почвенных условиях предлагает огромное количество и разнообразие фагов, способных быть изолированы от этого вида бактерий-хозяев. Бактериальные члены семьи Acintobacteriaceae являются наиболее заметным за их катаболических путей деградации непокорных соединений, таких как атразина и других различных пестицидов и гербицидов 1,2,3. Хотя большинство исследований было сделано с помощью экологических штаммов Arthrobacter, клинические изоляты этого рода находится в крови, моче, глаз и многих других человеческих источников все отображения филогенетическое неоднородность 4.
В то время как есть, а многочисленные исследования по Arthrobacter бактерий, всего в нескольких исследованиях сообщается на фагов, способных инфицировать членов этой разнообразной рода. Интересно, хотя, работа ранее на Arthrobacter фагов штрихи на нескольких ключевых отдельные темы, такие, как печатать почвы <EM> Arthrobacter видов 5, промышленного применения с целью уменьшения вредного пены в активированных обработки осадка растений 6, и работа выделив сайт-специфическое рекомбинации и интегразы гены 7.
Различные протоколы обогащения техника были использованы для создания чистого фага изолирует в Arthrobacter видов. Ранние процедуры включают инкубацию почвы с добавленными токсичных веществ, таких как никотин солей для периодов, превышающих один год 8, послуживших основанием для фагов, способных только заражает А. globiformis. Исследования, проведенные с помощью почву просачивается с лабильные органические появился для производства обнаруживаемыми фагов с помощью зубного налета методов анализа, опуская длинные периоды инкубации 8. Интересно, хотя, техника, напоминающие прямой металлизации был использован в прошлом, давая начало нескольким фагов в то время как все еще имея в частности, низкий уровень успеха в деятельности следователей 5, ссылаясь на прошлые исследования с низким уровнем успеха <sUP> 8.
В целом, методы изоляции, используемые в прошлом отличались за то, что мало эффективность в практике, несмотря на Arthrobacter рода, представляющих наиболее распространенные аэробные почву изолировать в природе 4,9, Ван Twest и Кропински 10 современные методы обогащения для выделения фагов из воды и почвы адаптировано из ранних методов, используемых для обогащения экологических бактериальных изолятов, но эти методы обогащения оказалась неэффективной в изоляции Arthrobacter фагов. Целью способа, описанного здесь, чтобы показать "доказательство концепции", что ранние способы обогащения может быть приспособлен, чтобы последовательно и эффективно изолировать фаги Arthrobacter, преодолевая прежние технические проблемы, связанные с выделением фагов из этой бактериальной рода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на многие предыдущие попытки изолировать фаги, способные заражать Arthrobacter хозяев, мы не имел большого успеха, используя стандартные процедуры по обогащению. Обобщенный метод бактериального обогащения разработаны и адаптированы ван Twest и Кропински 10 обогатить фагов…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование развития этого протокола была предоставлена Юго-Восточной Пенсильвании консорциума по высшему образованию и Департаментом Cabrini вузовской науки. Дополнительное финансирование и поддержка пришла от Аркадия университета и Непорочной университете. Мы особенно благодарны доктору Карен Snetselaar в Санкт-Иосифа университета за любезно принимая электронно-микроскопических изображений наших изолированных фагов. Дополнительная поддержка была оказана охотников Медицинского института Говарда Хьюза Наука Образование Альянс фага наступающих геномика и эволюционная наука программы (SEA-фаги).
Materials
| LB Broth powder | Fisher | BP9722-2 | It's best to order these in bulk. |
| Granulated Agar | Fisher | BP1423-2 | It's best to order these in bulk. |
| 0.22 um syringe filters | Fisher | 09-719A | |
| .22 um buchner filters | Fisher | 430320 | More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube. |
| Eppendorf Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 5 mL pipets individual | Fisher | 13-678-11D | |
| 50 mL conical tubes | Fisher | 76002844 | |
| 15 mL conical tubes | Fisher | 76002845 | |
| 10 mL pipets individual | Fisher | 13-676-10J | |
| 25 mL pipets individual | Fisher | 13-676-10K | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher | 1001-824 |
References
- Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).
- Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil. J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).
- Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine. Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).
- Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).
- Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters. Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).
- Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).
- Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a. Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70. J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).
- Casida, L. E., Liu, K. C. Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil. J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).
- Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis. J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).
- Twest, R., Kropinski, A. M. Bacteriophage Enrichment from Soil and Water. Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).
- Fullner, K. J., Hatfull, G. F. Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria. Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).
- Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells. J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).
- Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age. Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).
