En optimeret Berigelse Teknik til isolering af<em> Arthrobacter</em> Bakteriofag Arter fra jordprøve Isolerer

Summary

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Abstract

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

Introduction

Den allestedsnærværende Arthrobacter arter i jordmiljøer tilbyder et stort antal og mangfoldighed af fager, der kan isoleres fra denne art af værtsbakterier. Bakterielle medlemmer af Acintobacteriaceae familien er mest kendt for deres kataboliske veje for nedværdigende genstridige forbindelser som atrazin og forskellige andre pesticider og herbicider ^1,2,3. Selv om de fleste forskning er blevet gjort ved hjælp miljøet stammer af Arthrobacter er kliniske isolater af denne slægt findes i blod, urin, øjne, og mange andre menneskelige kilder alle udviser fylogenetisk heterogenitet ^4.

Mens der er en temmelig omfattende mængde forskning på Arthrobacter bakterier, kun få undersøgelser rapport om fager stand til at inficere medlemmer af denne forskelligartede slægt. Interessant dog arbejde tidligere på Arthrobacter fager rører på flere centrale forskellige emner som typning af jord <em> Arthrobacter arter ^5, industrielle anvendelser med henblik på at reducere skadelige skum i aktiverede slambehandlingsanlæg ^6, og arbejde fremhæve stedspecifik rekombination og integrase gener ^7.

Forskellige berigelse teknik protokoller er blevet anvendt til at generere ren fag isolater i Arthrobacter arter. Tidlige procedurer omfatter inkuberinger jord tilsat giftige stoffer som nikotin salte til perioder over et år ⁸ giver anledning til fager i stand til kun at inficere A. globiformis. Undersøgelser foretaget ved hjælp af jord sivet med labile organiske syntes at producere påviselige fager via plaqueanalyse teknikker, udelade langvarige inkubationsperioder ^8. Interessant var dog en teknik der ligner direkte plettering anvendt tidligere har givet anledning til adskillige fager mens der stadig er en særlig lav succesrate ved efterforskerne ^5, citerer tidligere undersøgelser med lave succesrater <sop> 8.

Samlet set isoleringsteknikker brugt tidligere var kendt for at have lidt effekt i praksis på trods af Arthrobacter slægt repræsenterer den mest almindelige aerobe jord isolere i naturen ^4,9, Van Twest og Kropinski ¹⁰ nuværende berigelse metoder til isolering af fager fra vand og jord tilpasset fra tidligere teknikker, der anvendes til at berige miljøet bakterieisolater men disse miljøberigelsesmetoder vist sig ineffektiv i at isolere Arthrobacter fager. Formålet med den her beskrevne fremgangsmåde er at vise "proof of concept", som de tidlige berigningsmetoder kan tilpasses konsekvent og effektivt isolere Arthrobacter fager, overvinde tidligere tekniske udfordringer forbundet med at isolere fager fra denne bakteriel slægt.

Protocol

1. Fremstilling af Arthobacter celler til fag Isolation Kultur Arthrobacter sp. KY3901 kolonier udstrøget på en Luria Bertaini (LB) agar plade inkuberet ved 30 ° C i 2-3 dage. Vælg en koloni og bruge en steril løkke for at føje den til 250 ml LB-bouillon i en forvirret dyrkningskolbe og inkuber i en rysteinkubator ved 225 rpm ved 30 ° C. Tillad cirka 24 timer af vækst for at opnå sene eksponentielle / tidlig stationær fase celler til faginfektion eksperimenter. Overvåg t…

Representative Results

For at demonstrere reproducerbarhed af det forbedrede berigelse teknik til Arthrobacter fager blev 30 forskellige jordprøver anvendes på forskellige tidspunkter og steder i løbet af foråret og sommeren 2014. Af disse 30 jordprøver unikke Arthrobacter fager blev indhentet fra 22 af de indsamlede jordprøver ved hjælp af denne berigelse procedure. Standarden berigelse fremgangsmåde gav unikke fager fra 3 af de samme jordprøver. Prøverne berigelse kan have en meget høj fagtiteren behøver indled…

Discussion

Trods mange tidligere forsøg på at isolere fager stand til at inficere Arthrobacter værter, vi havde lidt succes ved hjælp af standard berigelse procedurer. Den generaliserede metode til bakteriel berigelse udviklet og tilpasset af van Twest og Kropinski ¹⁰ at berige fager fra miljøprøver er fortsat grundlaget for størstedelen af berigelse procedurer. Dokumentation fra tidligere undersøgelser tyder på, at metoder til direkte plating har produceret påviselige plaque på stammer af Arthro…

Materials

LB Broth powder	Fisher	BP9722-2	It's best to order these in bulk.
Granulated Agar	Fisher	BP1423-2	It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters	Fisher	09-719A
.22 um buchner filters	Fisher	430320	More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes	Fisher	05-408-129
5 mL pipets individual	Fisher	13-678-11D
50 mL conical tubes	Fisher	76002844
15 mL conical tubes	Fisher	76002845
10 mL pipets individual	Fisher	13-676-10J
25 mL pipets individual	Fisher	13-676-10K
Whatman qualitative filter paper	Fisher	1001-824