طريقة لقياس آخر من Deubiquitinating الانزيمات في خطوط الخلايا وعينات الأنسجة
Summary
البروتوكول الحالي تفاصيل طريقة لقياس نشاط الانزيمات وظيفيا deubiquitinating مثلي. تحقيقات متخصصة تعديل تساهميا الانزيم وتسمح للكشف. يحمل هذا الأسلوب القدرة على تحديد أهداف علاجية جديدة.
Abstract
وقد تم مؤخرا تورط النظام بتحول-proteasome وفي أمراض مختلفة منها أمراض الاعصاب والسرطان. في ضوء ذلك، وتقنيات لدراسة آلية تنظيمية لهذا النظام ضرورية لتوضيح العمليات الخلوية والجزيئية للأمراض المذكورة أعلاه. استخدام راصة دموية المستمدة تحقيقات بتحول والواردة في هذه الورقة بمثابة أداة قيمة لدراسة هذا النظام. تفاصيل هذه الورقة الطريقة التي تمكن المستخدم من إجراء فحوصات التي تعطي رؤية مباشرة من deubiquitinating نشاط انزيم. الانزيمات Deubiquitinating تتحكم تدهور proteasomal وتبادل التماثل الوظيفي في مواقعهم النشطة، والتي تسمح للمستخدم للتحقيق في نشاط الأنزيمات متعددة في فحص واحد. ويتم الحصول لست] من خلال طيف تمزيق الخلايا الميكانيكية وحضنت مع موقع نشط تحقيقات توجيهات. يتم تمييزها الانزيمات وظيفية مع تحقيقات في حين تبقى الأنزيمات الخاملة غير منضم. بواسطة المدىنينغ هذا الاختبار، يحصل المستخدم على معلومات حول كل من النشاط والتعبير المحتمل لعدة إنزيمات deubiquitinating بطريقة سريعة وسهلة. الأسلوب الحالي بشكل ملحوظ أكثر فعالية من استخدام الأجسام المضادة الفردية لتوقع مائة deubiquitinating الإنزيمات في الخلايا البشرية.
Introduction
نظام بتحول-proteasome و(UPS) بمثابة واحد من مسارات التحلل الرئيسية في خلايا الثدييات. ركائز متجهة الى تدهور في proteasome ويتم تمييزها تساهميا مع البوليمرات من بتحول (UB) 1. قبل الركيزة المستهدفة تدخل proteasome وللتدهور، يجب إزالة علامة بولي بتحول. وهناك فئة من الإنزيمات المعروفة باسم deubiquitinating الأنزيمات (يصف) هي المسؤولة عن إزالة وإعادة تدوير جزيئات اليوبيكويتين 2. وقد توقع عليه من الجينوم البشري أن هناك ما يقرب من مائة يصف العمل في الخلية 3. مع هذا العدد الكبير من يصف السيطرة على العمليات الخلوية يو بي بوساطة، ودراسة هذه الإنزيمات يمثل تحديا منذ تقنيات مرنا لا تعطي معلومات عن النشاط والنشاف الغربي يعطي معلومات عن مستويات التعبير فقط.
استخدام راصة دموية الإنفلونزا (HA) الموسومة، يو بي المستمدة من الموقع موجه تحقيقات نشطة يسمح لوزارة الدفاع التساهميةification من يصف الوظيفي، وبالتالي يعطي رؤية مباشرة لنشاط هذه الإنزيمات على لطخة غربية 4. تحقيقات لديها مجموعة رد الفعل ثيول-C المحطة التي هي بمثابة الركيزة الانتحار لموقع نشط السيستين بقايا 5. مع هذه التحقيقات، فمن الممكن لدراسة النشاط والتعبير المحتمل للكثير من يصف في إطار كل من الحالات المرضية والفسيولوجية للخلية.
قد تورطت التغيرات في النشاط DUB في مجموعة من الحالات المرضية مثل الشلل الرعاش والزهايمر، وفقر الدم والسرطانات المختلفة 10/06. وتوفر هذه التقنية أداة قوية لدراسة المرض. في هذه الورقة، نقدم لك مجموعة من تطبيق هذه التقنية في خلايا هيلا وM17 التي تم هي lysed باستخدام الخرز الزجاجي. بالإضافة إلى ذلك، فإننا الخطوط العريضة لكيفية استخدام هذا الأسلوب في الماوس الحبل الشوكي عينات الأنسجة. المعلومات التي تم الحصول عليها من هذه التقنية يمكن أن تستخدم كنقطة انطلاق لتحديدالأهداف العلاجية فضلا عن وضع نماذج لدراسة الحالات المرضية المختلفة. الأداة المساعدة الحقيقية لهذه التقنية تكمن في قدرتها على تقديم معلومات عن يصف متعددة في فحص واحد.
Protocol
Representative Results
Discussion
منذ ubiquitination هو النشاط الخلوي الأساسي، وفهم آليات تنظيمية يمكن أن يكون المفتاح لنبش عمليات الأمراض وعلم الأمراض. استخدام HA الموسومة UB المستمدة من الموقع موجه تحقيقات نشطة ذكرت هنا يوفر وسيلة سهلة، ولكن ينطبق إلى حد كبير لدراسة UB بوساطة تدهور البروتين. هذا الأسلوب هو ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر مختبر لي من جامعة مينيسوتا لتقديم الماوس في العمود الفقري عينات الأنسجة الحبل التي تم استخدامها. وأيد هذا العمل من قبل وزارة الدفاع برنامج سرطان المبيض البحوث (OCRP) OC093424 لMB، من صندوق أبحاث السرطان والجماعة راندي آلة الحلاقة لMB ومينيسوتا سرطان المبيض التحالف (موكا) إلى ميغا بايت. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
References
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
