細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法
Summary
現在のプロトコルは、機能的に相同脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法を詳述します。特殊なプローブは、共有結合酵素を変更し、検出を可能にします。この方法は、新たな治療標的を同定する可能性を保持しています。
Abstract
ユビキチン – プロテアソーム系は、最近、神経変性疾患および癌を含む種々の病態に関与しています。この観点から、このシステムの調節機構を研究するための技術は、上記疾患の細胞および分子プロセスを解明するために不可欠です。本稿で概説した赤血球凝集素由来のユビキチンプローブの使用は、このシステムの研究のための貴重なツールとして機能します。本稿では、酵素活性を脱ユビキチン化の直接的な可視化を与えるアッセイを実行することを可能にする方法を詳述します。脱ユビキチン化酵素は、プロテアソーム分解を制御し、ユーザーが1つのアッセイで複数の酵素の活性を調査することができ、それらの活性部位での機能的相同性を共有します。溶解物を、穏やかな機械的な細胞破壊を介して得られた活性部位指向プローブと共にインキュベートします。非アクティブな酵素が結合していないままで機能的酵素は、プローブでタグ付けされています。実行で寧このアッセイは、ユーザが迅速かつ簡単な方法で活動し、複数の脱ユビキチン化酵素の潜在的な発現の両方の情報を取得します。現在の方法は、ヒト細胞における予測百脱ユビキチン化酵素のための個々の抗体を使用するよりも大幅に効率的です。
Introduction
ユビキチン – プロテアソームシステム（UPS）は、哺乳動物細胞内の主要な分解経路の一つとして機能します。プロテアソームで分解のためにバインドされた基板は、共有結合、ユビキチン（Ubが）1のポリマーとタグ付けされています。標的基質は、分解のためのプロテアソームに入る前に、ポリユビキチンタグを削除する必要があります。脱ユビキチン化酵素として知られる酵素のクラス（のDUB）はユビキチン分子2の除去とリサイクルを担当しています。これは、セル3内の作業約100のDUBがあることがヒトゲノムから予測されています。 UB-媒介細胞プロセスを制御するのDUBのような大規模な数と、これらの酵素を研究するだけで発現レベルに関する情報を提供するmRNA技術が活性およびウェスタンブロッティングの情報を与えないので、課題を提示します。
インフルエンザ赤血球凝集素（HA）の使用は、共有結合を可能にするMOD活性部位指向プローブをUB-由来、タグ付け機能のDUBのification、したがって、ウェスタンブロット4のこれらの酵素の活性の直接可視化を提供します。プローブは、活性部位のシステイン残基5ため自殺基質として作用するC末端のチオール反応性基を有します。これらのプローブによれば、細胞の病理学的および生理学的状態の両方で、多くのDUB活性の潜在的な発現を研究することが可能です。
DUB活性の変化は、パーキンソン病、アルツハイマー病、貧血および様々な癌6-10のような病理学的条件の範囲に関与しています。この技術は、疾患の研究のための強力なツールを提供します。本論文では、ガラスビーズを用いて溶解されているHeLa細胞およびM17細胞におけるこの技術の適用を示します。さらに、我々は、マウスの脊髄組織サンプルでこのメソッドを使用する方法の概要を示します。この技術から得られた情報を識別するための出発点として使用することができ治療標的ならびに異なる疾患状態の研究のためのモデルを確立します。この技術の真の有用性は、単一のアッセイで複数のDUBに関する情報を提供する能力にあります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ユビキチン化は、基本的な細胞活動であるので、調節機構を理解することは、疾患や病態のプロセスを発掘するための鍵である可能性があります。 HAの使用は、UB-媒介タンパク質分解を研究するための簡単な、しかし非常に適用可能な方法を提供し、ここで報告したUb由来の活性部位特異的プローブをタグ付け。この方法は、個別のDUBのそれぞれの研究よりも速く、安価です。
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、使用されたマウスの脊髄の組織サンプルを提供するためのミネソタ大学の李研究室に感謝したいと思います。この作品は、MBにMBに、ランディシェーバーがん研究とコミュニティ基金MBにミネソタ卵巣癌アライアンス（MOCA）による国防総省の卵巣癌研究プログラム（OCRP）OC093424によってサポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定または原稿の準備で何の役割も持っていません。
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
References
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