Metodo per la misurazione dell'attività di Deubiquitinating enzimi in linee di cellule e tessuti Campioni
Summary
Dettagli Il protocollo attuale un metodo per misurare l'attività degli enzimi funzionalmente omologo deubiquitinating. Sonde specializzate covalentemente modificano l'enzima e consentono il rilevamento. Questo metodo ha il potenziale di identificare nuovi bersagli terapeutici.
Abstract
Il sistema ubiquitina-proteasoma è stato recentemente coinvolto in diverse patologie, tra cui le malattie neurodegenerative e il cancro. Alla luce di questo, tecniche per studiare il meccanismo di regolazione di questo sistema sono essenziali per chiarire i processi cellulari e molecolari delle malattie summenzionate. L'uso di emoagglutinina derivante sonde ubiquitina delineate nel presente documento è uno strumento prezioso per lo studio di questo sistema. Dettagli Questo documento un metodo che consente all'utente di eseguire saggi che danno una visualizzazione diretta della deubiquitinating attività enzimatica. Enzimi Deubiquitinating controllano la degradazione del proteasoma e condividono un'omologia funzionale ai loro siti attivi, che permette all'utente di indagare l'attività di diversi enzimi in un test. Lisati sono ottenuti attraverso dolce rottura delle cellule meccanico e incubate con sito attivo sonde dirette. Enzimi funzionali sono contrassegnati con le sonde mentre enzimi inattivi rimangono non legato. Di corsaning questo test, l'utente ottiene informazioni sia l'attività e potenziale espressione di molteplici enzimi deubiquitinating in modo facile e veloce. Il metodo attuale è molto più efficiente rispetto all'utilizzo anticorpi individuali per i predetti cento enzimi deubiquitinating nella cellula umana.
Introduction
Il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) serve come una delle principali vie di degradazione in cellule di mammifero. Substrati legati per la degradazione nel proteasoma sono covalentemente contrassegnati con polimeri di ubiquitina (Ub) 1. Prima che il substrato bersaglio entra proteasoma per la degradazione, l'etichetta poli-ubiquitina deve essere rimosso. Una classe di enzimi noti come deubiquitinating enzimi (dubs) è responsabile per la rimozione e il riciclaggio delle molecole di ubiquitina 2. E 'stato previsto dal genoma umano che ci sono quasi un centinaio dubs che lavorano nella cella 3. Con un gran numero di dubs che controllano processi cellulari Ub-mediate tale, lo studio di questi enzimi rappresenta una sfida in quanto le tecniche di mRNA non danno informazioni sull'attività e western blotting dà solo informazioni sui livelli di espressione.
L'uso di emoagglutinina influenzale (HA) tagged, Ub-derived sito diretto sonde attive permette una covalente modification dei dubs funzionali e quindi dà una visualizzazione diretta delle attività di questi enzimi in un Western Blot 4. Le sonde hanno un gruppo tiolo reattivo C-terminale che funge da substrato suicida per il sito attivo residuo di cisteina 5. Con queste sonde, è possibile studiare l'attività e potenziale espressione di molti DUBS sotto le due stati patologici e fisiologici della cellula.
Le variazioni di attività DUB sono stati implicati in una serie di condizioni patologiche come il Parkinson, l'Alzheimer, anemia e vari tipi di cancro 6-10. Questa tecnica fornisce un potente strumento per lo studio della malattia. In questo lavoro, mostriamo l'applicazione di questa tecnica in cellule HeLa e M17 che sono state lisate usando perline di vetro. Inoltre, si delineano come utilizzare questo metodo in campioni di tessuto del midollo spinale del mouse. Le informazioni ottenute da questa tecnica può essere usato come punto di partenza per l'identificazionebersagli terapeutici così come i modelli che stabiliscono per lo studio delle diverse condizioni di malattia. La vera utilità di questa tecnica risiede nella sua capacità di fornire informazioni su più dubs in un singolo dosaggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dal momento che l'ubiquitinazione è un attività cellulare fondamentale, la comprensione dei meccanismi di regolamentazione potrebbe essere la chiave per dissotterrare i processi di malattia e patologia. L'uso di HA tagged sito diretto sonde attive Ub-derivati qui riportati fornisce un metodo semplice, ma altamente applicabile per studiare la degradazione delle proteine Ub-mediata. Questo metodo è più rapido e meno costoso di studiare ciascuno dei dubs singolarmente.
I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il laboratorio Lee dell'Università del Minnesota per fornire i campioni di tessuto del midollo spinale del mouse che sono stati utilizzati. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Difesa Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 a MB, con la Ricerca sul Cancro e Fondo comunitario Randy Shaver a MB e dal Minnesota Ovarian Cancer Alliance (MOCA) a MB. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
References
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