Méthode de mesure de l'activité des enzymes de dé-ubiquitination dans des lignées cellulaires et des échantillons de tissus
Summary
Le protocole actuel détaille un procédé pour mesurer l'activité des enzymes fonctionnellement homologue désubiquitination. Sondes spécialisées modifier de manière covalente l'enzyme et permettent de détecter. Cette méthode a le potentiel d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Abstract
Le système ubiquitine-protéasome a été récemment impliqué dans différentes pathologies dont les maladies neurodégénératives et des cancers. À la lumière de cela, des techniques pour étudier le mécanisme de régulation de ce système sont essentielles pour élucider les processus cellulaires et moléculaires des maladies susmentionnées. L'utilisation de l'hémagglutinine dérivée d'ubiquitine sondes décrites dans le présent document constitue un outil précieux pour l'étude de ce système. Ce document décrit en détail une méthode qui permet à l'utilisateur d'effectuer des tests qui donnent une visualisation directe de l'activité enzymatique désubiquitination. Enzymes de dé-ubiquitination contrôlent dégradation par le protéasome et partager homologie fonctionnelle sur leurs sites actifs, ce qui permet à l'utilisateur d'enquêter sur l'activité de plusieurs enzymes dans un essai. Lysats sont obtenus grâce à une rupture mécanique doux cellulaire et incubées avec site actif sondes dirigées. Enzymes fonctionnelles sont étiquetés avec les sondes en enzymes inactives demeurent non. En termeNing cet essai, l'utilisateur obtient des informations à la fois sur l'activité et l'expression potentielle de plusieurs enzymes de dé-ubiquitination d'une manière rapide et facile. La méthode actuelle est nettement plus efficace que d'utiliser des anticorps individuels pour les cent prédits enzymes de dé-ubiquitination dans la cellule humaine.
Introduction
Le système ubiquitine-protéasome (UPS) sert comme l'une des principales voies de dégradation dans la cellule de mammifère. Substrats liés à la dégradation dans le protéasome sont étiquetés de manière covalente avec des polymères de l'ubiquitine (Ub) 1. Avant le substrat ciblé entre le protéasome de dégradation, l'étiquette de poly-ubiquitine doit être retiré. Une classe d'enzymes appelées enzymes de dé-ubiquitination (DUB) est responsable de l'élimination et le recyclage des molécules d'ubiquitine 2. Il a été prédite à partir du génome humain qui, il ya près d'une centaine DUBs travaillant dans la cellule 3. Avec un si grand nombre de processus cellulaires DUBs contrôle Ub-médiation, l'étude de ces enzymes représente un défi, car les techniques d'ARNm ne donnent pas d'informations sur l'activité et western blot ne donne des informations sur les niveaux d'expression.
L'utilisation de la grippe hémagglutinine (HA) marqué, Ub sondes dérivées de sites actifs dirigée permet un mod covalenteification des DUBs fonctionnels et donc donne une visualisation directe de l'activité de ces enzymes sur un western blot 4. Les sondes ont un groupe réactif thiol C-terminal qui sert de substrat suicide pour le résidu cysteine du site actif 5. Avec ces sondes, il est possible d'étudier l'activité et l'expression de nombreux DUBs potentiel sous les deux états pathologiques et physiologiques de la cellule.
Changements dans l'activité DUB ont été impliqués dans une gamme de conditions pathologiques comme la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, l'anémie et divers cancers 6-10. Cette technique fournit un outil puissant pour l'étude des maladies. Dans le présent article, nous montrons l'application de cette technique dans les cellules HeLa et M17 qui ont été lysées en utilisant des billes de verre. En outre, nous décrivons comment utiliser cette méthode dans des échantillons de tissus de la moelle épinière de souris. L'information obtenue à partir de cette technique peut être utilisée comme un point de départ pour identifiercibles thérapeutiques ainsi que l'établissement de modèles pour l'étude des différents états pathologiques. La véritable utilité de cette technique réside dans sa capacité à fournir des informations sur plusieurs DUBs dans un seul essai.
Protocol
Representative Results
Discussion
Depuis ubiquitination est une activité cellulaire fondamental, la compréhension des mécanismes de régulation pourrait être la clé pour déterrer les processus de la maladie et de la pathologie. L'utilisation de HA marqué sites dirigé sondes actives Ub dérivés rapportés ici fournit une méthode simple, mais très applicable pour l'étude de la dégradation des protéines Ub-médiation. Cette méthode est plus rapide et moins coûteux que d'étudier chacun des DUBs individuellement.
<p class="jo…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le laboratoire Lee de l'Université du Minnesota pour fournir les échantillons de tissus de la moelle épinière de souris qui ont été utilisés. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Défense Programme Cancer de l'ovaire de la recherche (OCRP) de OC093424 à MB, par le Fonds communautaire de recherche et cancer Randy Shaver MB et par le Minnesota Cancer de l'ovaire Alliance (MOCA) à MB. Les bailleurs de fonds ne jouaient aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou de la préparation du manuscrit.
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
References
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