세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법
Summary
현재 프로토콜은 기능적 상동 deubiquitinating 효소의 활성을 측정하는 방법을 자세히 설명. 전문화 된 프로브에 공유 효소를 검출하고 수정할 수 있도록. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 잠재력을 보유하고있다.
Abstract
유비퀴틴 – 프로 테아 좀 시스템은 최근 신경 변성 질환 및 암을 비롯한 다양한 병리에 관여한다. 이러한 관점에서,이 시스템의 조절 메커니즘을 연구하는 기술은 전술 한 질환의 세포 및 분자 적 프로세스를 해명에 필수적이다. 이 논문에 설명 된 적혈구 응집소 유래 유비퀴틴 프로브의 사용은이 시스템의 연구를위한 유용한 도구로서 기능한다. 이 논문은 효소 활성을 deubiquitinating의 직접적인 시각화를 제공 분석을 수행 할 수 있도록 해주는 방법을 자세히 설명합니다. Deubiquitinating 효소는 프로 테오 열화를 제어하고, 사용자가 하나의 분석에서 여러 효소의 활성을 조사 할 수 있도록 자신의 활성 부위에서 기능적 유사성을 공유한다. 해물을 부드러운 기계 세포 파괴를 통해 얻은 액티브 사이트 감독 프로브와 함께 배양한다. 비활성 효소가 결합되지 않은 유지하면서 기능 효소는 프로브와 태그. 실행으로닝이 분석에서, 사용자는 활성 및 빠르고 손쉽게 방식으로 여러 deubiquitinating 전위 효소 발현 모두에 대한 정보를 획득한다. 현재의 방법은 인간 세포에서 예측 백 deubiquitinating 효소 개별 항체를 사용하는 것보다 훨씬 더 효율적이다.
Introduction
유비퀴틴 – 프로 테아 좀 시스템 (UPS)은 포유 동물 세포에서 주요 분해 경로의 하나로서 역할을한다. 프로 테아 좀 저하 행 기판을 공유 유비퀴틴 (UB) 1 중합체와 태그. 타겟 기판 분해 테아로 들어가기 전에, 폴리 – 유비퀴틴 태그는 제거되어야한다. 효소 (더빙) deubiquitinating 알려진 효소 클래스 유비퀴틴 분자 (2)의 제거 및 재활용 할 책임이있다. 이는 셀 3의 백 작업 거의 더빙이 있다는 인간 게놈으로부터 예측되어왔다. UB-매개 세포 과정을 조절 움직여 같은 많은 수의,이 효소를 공부에만 발현 수준에 대한 정보를 제공 mRNA의 기술 활동 및 서부 블로 팅에 대한 정보를 제공하지 않기 때문에 문제를 제시한다.
인플루엔자 헤 마글 루티 닌 (HA)의 사용은 공유 개조를 허용 활성 부위 지향 프로브 UB 유래, 태그기능 더빙 따라서의 형 치수는 웨스턴 블롯 4에이 효소의 활동의 직접적인 시각화를 제공합니다. 프로브는 활성 부위 시스테인 잔기 5 자살 기질로서 작용 C 말단 티올 반응성기를 갖는다. 이러한 프로브, 상기 셀의 양쪽 병리 생리 학적 상태에 따라 다수의 더빙의 활성 및 발현 가능성을 연구 할 수있다.
DUB 활성의 변화는 파킨슨, 알츠하이머, 빈혈 및 각종 암 6-10 같은 병리 적 상태의 범위에 연루되어왔다. 이 기술은 질병의 연구를위한 강력한 도구를 제공합니다. 본 논문에서는 유리 비드를 사용하여 용해 된 헬라 세포 및 M17에서이 기술의 애플리케이션을 도시한다. 또한, 우리는 마우스 척수 조직 샘플에서이 방법을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 방법에서 얻은 정보를 식별하기위한 출발점으로 사용될 수있다치료 대상뿐만 아니라 다른 질병 상태의 연구를위한 모델을 확립. 이 기술의 진정한 유틸리티는 단일 분석에서 여러 더빙에 대한 정보를 제공 할 수있는 능력에있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유비퀴틴은 기본적인 셀룰러 활성이기 때문에, 규제 메커니즘을 이해하는 것이 질병의 병리 과정을 발굴하는 키가 될 수있다. HA의 사용은 여기에보고 UB 유래 활성 부위 감독 프로브는 UB-매개 단백질 분해 연구를위한 쉬운,하지만 매우 적용 할 수있는 방법을 제공하는 태그. 이 방법은 신속하고 저렴 개별적 더빙 각각 공부보다 길다.
유리 비드를 사용하는 -이 방법에서, 세?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 사용 된 마우스 척수 조직 샘플을 제공하기 위해 미네소타 대학의 리 실험실에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 MB의 랜디 면도기 암 연구 및 지역 사회 기금과 미네소타 난소 암 연맹 (MOCA)이 MB의에 의해, 국방 난소 암 연구 프로그램 (OCRP) MB의 OC093424의 부서에 의해 지원되었다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
References
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
