Метод измерения активности ферментов Deubiquitinating в клеточных линиях и образцы тканей
Summary
Текущий протокол детали метод для измерения активности функционально гомологичны deubiquitinating ферментов. Специализированный зонды, ковалентно модифицировать фермент и позволяют для обнаружения. Этот метод имеет потенциал для выявления новых терапевтических мишеней.
Abstract
Система убиквитин-протеасомный недавно был вовлечен в различных патологий в том числе нейродегенеративных заболеваний и рака. В свете этого, методы для изучения механизма регулирования этой системы имеют важное значение для выяснения клеточных и молекулярных процессов вышеупомянутых заболеваний. Использование гемагглютинина получены убиквитиновых зондов, описанных в этой статье служит ценным инструментом для изучения этой системы. В этом документе подробно описывается метод, который позволяет пользователю выполнять анализы, которые дают прямой визуализации deubiquitinating активность фермента. Deubiquitinating ферменты борьбы с деградацией протеасомной и поделиться функциональную гомологию в их активных сайтов, что позволяет пользователю исследовать деятельность нескольких ферментов в одном анализе. Лизаты получают посредством разрушения нежной механической клеток и инкубировали с активным сайтом направленных зондов. Функциональные ферменты помечены с зондами, а неактивные ферменты остаются несвязанными. По ходуНин этот анализ, пользователь получает информацию как о деятельности и потенциальных выражения нескольких deubiquitinating ферментов в быстрой и легкой манере. Нынешний метод является значительно более эффективным, чем при использовании отдельных антител для предсказанных сто deubiquitinating ферментов в клетке человека.
Introduction
Система убиквитин-протеасомный (ИБП) служит одним из основных путей деградации в клетке млекопитающего. Основания, связанные деградации в протеасоме ковалентно помечен полимеров убиквитином (UB) 1. Перед мишенью субстрат поступает в протеасомы для деградации, поли-убиквитин метка должна быть удалена. Класс ферментов, известных как deubiquitinating ферменты (DUBs) несет ответственность за удаление и утилизацию молекул убиквитиновых 2. Было предсказано, из генома человека, что почти в сто DUBs, работающие в клетке 3. При таком большом количестве Dubs контролирующих Ub-клеточные процессы, опосредованные, изучение этих ферментов представляет собой сложную задачу, поскольку методы мРНК не дают информацию о деятельности и вестерн-блоттинга только дает информацию о уровней экспрессии.
Использование гриппа гемагглютинина (HA) помечены, Ub, полученных активных сайтов направлены зонды позволяет ковалентной модафикация функциональных называет и поэтому дает прямой визуализации активности этих ферментов на вестерн-блоттинга 4. Зонды имеют С-концевой тиоловую реактивную группу, которая служит в качестве субстрата для самоубийства активного сайта цистеина остатком 5. С помощью этих зондов, можно изучать деятельность и потенциал экспрессию многих называет по обе патологических и физиологических состояниях клетки.
Изменения DUB активности были вовлечены в диапазоне патологических состояний, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, анемии и различных видов рака 6-10. Эта методика представляет собой мощный инструмент для изучения болезни. В настоящей работе мы показываем, применение этой методики в HeLa и M17 клеток, которые были лизированных с помощью стеклянных бусин. Кроме того, мы выделяем, как использовать этот метод в мышиных образцах ткани спинного мозга. Информация, полученная из этого метода могут быть использованы в качестве отправной точки для определениятерапевтические цели, а также устанавливающие модели для изучения различных заболеваний. Истинный полезность этого метода состоит в его способности обеспечивать информацию о нескольких называет в одном анализе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Так убиквитинирования является фундаментальным клеточная активность, понимание механизмов регулирования может быть ключом к раскопкам процессы болезни и патологии. Использование ГК помечены Ub-активные производные сайт направлено зонды, описанные здесь, обеспечивает легкий, но очен…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить лабораторию Ли из Университета Миннесоты за предоставление образцов мыши ткани спинного мозга, которые были использованы. Эта работа была поддержана Департаментом оборонной программы рака яичников исследований (ОГОС) OC093424 к МБ, научно-исследовательским и сообщества Рак фонда Рэнди бритвы к МБ и Миннесота яичников Рак Альянс (MOCA) в МБ. Доноры не было никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
References
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
