Método para medir la actividad de enzimas deubiquitinating en líneas celulares y muestras de tejido
Summary
El actual protocolo detalla un método para medir la actividad de las enzimas funcionalmente homóloga deubiquitinating. Sondas especializadas modifican covalentemente la enzima y permiten la detección. Este método tiene el potencial de identificar nuevas dianas terapéuticas.
Abstract
El sistema ubiquitina-proteasoma ha sido recientemente implicada en diversas patologías que incluyen enfermedades neurodegenerativas y cáncer. A la luz de esto, las técnicas para estudiar el mecanismo de regulación de este sistema son esenciales para elucidar los procesos celulares y moleculares de las enfermedades mencionadas anteriormente. El uso de hemaglutinina derivado sondas ubiquitina descritos en este documento sirve como una valiosa herramienta para el estudio de este sistema. Este documento detalla un método que permite al usuario realizar ensayos que dan una visualización directa de deubiquitinating actividad de la enzima. Enzimas deubiquitinating control de la degradación proteasomal y comparten homología funcional a sus sitios activos, que permite al usuario investigar la actividad de múltiples enzimas en un ensayo. Los lisados se obtienen a través suave ruptura celular mecánica y se incubaron con sitio activo sondas dirigidas. Enzimas funcionales etiquetados con las sondas mientras enzimas inactivas permanecen sin unir. Por plazoNing este ensayo, el usuario obtiene información tanto sobre la actividad y la expresión potencial de múltiples enzimas deubiquitinating de una manera rápida y fácil. El método actual es significativamente más eficiente que el uso de anticuerpos individuales para los predichos cien enzimas deubiquitinating en la célula humana.
Introduction
El sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) sirve como una de las principales vías de degradación en la célula de mamífero. Sustratos con destino a la degradación en el proteasoma etiquetados de forma covalente con polímeros de ubiquitina (Ub) 1. Antes de que el sustrato elegido como diana entra en el proteasoma para la degradación, la etiqueta de poli-ubiquitina debe ser eliminado. Una clase de enzimas conocidas como deubiquitinating enzimas (DUBs) es responsable de la eliminación y el reciclaje de moléculas de ubiquitina 2. Se ha predicho desde el genoma humano que hay cerca de un centenar DUBs que trabajan en la celda 3. Con un gran número de DUBs que controlan los procesos celulares mediados por Ub tal, el estudio de estas enzimas presenta un desafío ya que las técnicas de ARNm no dan información sobre la actividad y el Western Blot sólo da información sobre los niveles de expresión.
El uso de la hemaglutinina de la gripe (HA) etiquetada, Ub derivada de sitio dirigido sondas activas permite un mod covalenteficación de los DUBs funcionales y por lo tanto da una visualización directa de la actividad de estas enzimas en un Western blot 4. Las sondas tienen un grupo reactivo tiol C-terminal que sirve como un sustrato suicida para la cisteína residuo sitio activo 5. Con estas sondas, es posible estudiar la actividad y la expresión potencial de muchos DUBs bajo las dos estados patológicos y fisiológicos de la célula.
Cambios en la actividad DUB han sido implicados en una amplia gama de condiciones patológicas tales como Parkinson, Alzheimer, anemia y diversos tipos de cáncer 6-10. Esta técnica proporciona una poderosa herramienta para el estudio de la enfermedad. En el presente trabajo, se muestra la aplicación de esta técnica en las células HeLa y M17 que han sido lisadas usando perlas de vidrio. Además, se describe cómo utilizar este método en muestras de tejido de la médula espinal de ratón. La información obtenida de esta técnica se puede utilizar como punto de partida para la identificación dedianas terapéuticas así como el establecimiento de modelos para el estudio de diferentes condiciones de la enfermedad. La verdadera utilidad de esta técnica radica en su capacidad para proporcionar información sobre múltiples DUBs en un único ensayo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desde ubiquitinación es una actividad celular fundamental, la comprensión de los mecanismos de regulación podría ser la clave para sacar a la luz los procesos de la enfermedad y la patología. El uso de HA etiquetada sitio dirigido sondas activas derivadas de Ub aquí presentados proporcionan un método sencillo, pero muy aplicable para el estudio de la degradación de proteínas mediada por Ub. Este método es más rápido y menos costoso que el estudio de cada uno de los DUBs individualmente.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias al laboratorio de Lee, de la Universidad de Minnesota para proporcionar las muestras de tejido de la médula espinal de ratones que fueron utilizados. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Programa de Defensa de ovario de Investigaciones Oncológicas (OCRP) OC093424 a MB, por el Fondo de Investigación del Cáncer y la Comunidad Randy máquina de afeitar de MB y por el cáncer ovárico de Alianza Minnesota (MOCA) a MB. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión de publicar o preparación del manuscrito.
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
References
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