Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.
Verkapselung von Zellen entwickelt worden, um lebensfähige Zellen in semipermeable Membranen einschließen. Die transplantierten Zellen können eingekapselt Gewicht niedermolekularen Metaboliten in Gewebe des behandelten Wirts austauschen, um langfristiges Überleben zu erreichen. Die semipermeable Membran ermöglicht engrafted eingekapselten Zellen um die Abstoßung durch das Immunsystem zu vermeiden. Die Verkapselung Verfahren wurde entwickelt, um eine kontrollierte Freisetzung von bioaktiven Verbindungen, wie Insulin, andere Hormone und Cytokine aktivieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Verkapselung von Abbauzellen, die Lipide für die Wärmeerzeugung und Energieverlust (Thermogenese) im intra-abdominale Fettgewebe von fettleibigen Mäusen verbrauchen. Verkapselung von thermogenic katabolen Zellen können potentiell für die Prävention und Behandlung von Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes. Eine weitere mögliche Anwendung der katabolen Zellen können Entgiftung von Alkoholen oder anderen toxischen Metaboliten und Umweltschadstoffe sind.
Zunehmende Häufigkeit von chronischen Krankheiten 1 hat Studien über die Transplantation von therapeutischen Zellpopulationen 2 stimuliert. Syngenen oder allogenen Stammzellen sind die am häufigsten verwendeten Zelltypen für diese Anwendungen 2. Jedoch sind diese Behandlungen nicht erlauben Steuerung Differenzierung und Migration von Stammzellen nach der Implantation und sind nicht kosteneffizient. Die Transplantation von genetisch modifizierten Zellen mit nützlichen Funktionen rechnet die Verbesserung der Behandlung vieler Krankheiten. Allerdings sind genetische Zell Änderungen durch den Host-Immunsystem erkannt, deshalb diese Behandlungen benötigen Immunsuppression 3. Verkapselung von Zellen, die Insulin wurde von Dr. Chang 4 entwickelt. Die Technik basiert auf Verkapselung der Zellen im Alginat-Tröpfchen, die in einer Calciumchloridlösung eingetaucht sind, beruht. Alginat Moleküle aus Mannuronsäure (M) und Guluronsäure (G) und können durch Ca 2+ verbunden werden. Nach der Gelierung werden die Perlen ein Poly-L-Lysin (PLL) suspendiert. Während dieser Stufe bindet PLL bis G und M in der Alginat-Moleküle, die die Kapselmembran herstellt. Die Porosität der Kapselmembran kann durch Variation der M und PLL-Konzentrationen, die Inkubationszeit und der Temperatur moduliert werden. Die Bindung von PLL hängt auch von der Art und Konzentration des Alginats. Alginat Matrizen mit Ca 2+ -Ionen vernetzt, sind instabil in der physiologischen Umgebung oder in gemeinsamen Pufferlösungen mit einer hohen Konzentration an Phosphat und Citrationen. Diese Puffer können Ca 2+ aus dem Alginat zu extrahieren und zu verflüssigen den Kern. Verflüssigung des Alginats Kern schafft Platz in den Kapseln für die zelluläre Bewegung und Wachstum. Zellen in polyanionischen Alginats mit polykationische Poly-L-Lysin (APL) eingekapselt sind undurchlässig für Immunglobuline aber Zustrom von Nährstoffen und Ausstrom von Toxinen. Objekte Das APL ermöglichen die langfristige survival von verkapselten Zellen nach Transplantation in genetisch verschiedenen Hosts. Elliott et al. Berichteten über die Überlebensrate von funktionierenden eingekapselt Schweinepankreaszellen in einem menschlichen Patienten neun Jahre nach der Implantation 5.
Verkapselungstechniken können in Mikroverkapselung (3-800 & mgr; m) und Makroverkapselung (größer als 1000 & mgr; m) klassifiziert werden. Mikrokapseln sind haltbarer als Makrokapseln 6. Seit seiner Entdeckung durch Dr. Chang und seine Kollegen im Jahr 1964, Mikroverkapselung wurde in großem Umfang für die Verkapselung von anabolen Zellen Insulin produzieren, andere Hormone, und bioaktive Moleküle 7 verwendet. Diese Behandlungen konfrontiert mehrere Herausforderungen in das Wirtsgewebe einschließlich Fibrose und Immunantwort 8. Anfänglich sind die Nebenwirkungen auf die Qualität des Biopolymeren bezogen wurden gelöst. Jedoch Transplantation von anabolen Zellen noch initiiert Nebenwirkungen, wie Fibrose infolge der Hormon overproduktion außerhalb eines spezialisierten Drüse.
In den letzten Jahrzehnten, Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes hat epidemische Ausmaße erreicht 9. Mehr als 30% der erwachsenen Menschen weltweit sind übergewichtig und fettleibig 10. Vermehrtem intraabdominellen (IAB) Fettbildung erhöht die Inzidenz der chronischen Entzündung und fördert die Typ-2-Diabetes, Herz-Kreislauf- Erkrankungen, bestimmte Krebsarten und andere Begleiterkrankungen 11-13. Mehrere Beweis vorgeschlagen, dass Pathogenese mit IAB Fett verbunden sind, können durch spezifische Fettzellen verhindert werden. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Transplantation von subkutanen Fettzellen in IAB-Region kann den Stoffwechsel zu verbessern und die Adipositas und Insulinresistenz bei Nagern in vivo 14 gezeigt. Senkung von Adipositas und Insulinresistenz mit thermogenic Adipozyten Energie aufnehmend in Form von Wärme 15,16 in Verbindung gebracht. Thermogenic Änderung der Fettzellen kann durch eine stabile Transfektion erreicht werdenvon Genen, die an der mitochondrialen Protonenentkopplungs wie Abkoppeln Protein 1 (UCP1) oder von Genen regulieren die Expression von UCP1 und andere thermogene Gene 15,16. Unsere bisherigen Studien zeigten, dass Mängel in der Aldehyddehydrogenase 1 a1 (Aldh1a1) führt zum thermogene Remodellierung von Iab Fett, Fettsucht und Insulinresistenz bei diesen Mäusen 17,18 verringert. Bemerkenswert ist, Verkapselung von thermogenic Aldh1a1 mangel (Aldh1a1 – / -) Präadipozyten vermittelt gleiche therapeutische Wirkung im IAB Fett bei übergewichtigen Wildtyp-Mäusen, was darauf hindeutet, neue therapeutische Möglichkeiten zur Behandlung der IAB-Fett 18. In experimentellen Einstellungen verkapselten Zellen können die Forscher die Auswirkungen spezifischer Zellpopulationen in einer kosteneffektiven Weise 19 zu studieren. Hier diskutieren wir die Methode der Verkapselung eines thermogene katabolen Zelllinie und ihre Labor und therapeutische Anwendung in einem Mausmodell für Fettleibigkeit. Das Protokoll beschreibt three Phasen für die Mikrokapselherstellung (Abbildung 1): die Bildung von Alginat-Mikrokugeln (Figur 1A), die Bildung der polykationische Poly-L-Lysin (PLL) Membranen, die auf der Oberfläche der Mikrokügelchen, (1B), und das Entfernen des Alginat-Kerne (1C).
Verschiedene Verfahren wurden verwendet, um Zellen, einschließlich Trocknen, Extrudieren und Emulsion 19 einzukapseln. In diesem Verfahren werden die Alginatkapseln durch eine Nadel extrudiert, dann mit PLL beschichtet und das Alginat Kern aufgelöst wird, um die Verkapselung zu vervollständigen. Obwohl dieses Verfahren seit Jahren verwendet worden ist, ist die Bildung der Kügelchen mit der gewünschten Grße und Kugelform immer noch eine Herausforderung. Die Größe der Kapseln ist stark abhängig von der…
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten Jennifer Petrosino und David Disilvestro für redaktionelle Hilfe danken. Diese Arbeit wurde von Verleihungsnummer 20020728 von der American Egg Board und Verleihungsnummer 10040042 von Novo Nordisk Pharma als auch von der Food Innovation Center, Referat für Internationale Angelegenheiten, Center for Advanced Functional Foods Forschung und Entrepreneurship an OSU sowie die unterstützten National Science Foundation gewähren EWG-0914790 (LJL). Die beschriebene wurde von Preis Anzahl R21OD017244 (OZ) und UL1RR025755 (OSUCCC) unterstützt von der National Center for Research Resources Projekt, die das Amt des Direktors, des National Institutes of Health (OD) für medizinische Forschung und finanziert und von der NIH-Roadmap unterstützt NCI P30CA16058. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Center for Research Resources oder der National Institutes of Health.
Encapsulation device (VAR V1) | Nisco | LIN-0042 | None |
KD scientific syringe pump | KD scientific | 780100Y | None |
Olympus microscope | Olympus Optical | IX70-S8F2 | None |
Sodium alginate | Sigma | MKBP8122V | None |
Poly-l-lysine hydrobromide (PLL) | Sigma | 020M5006V | None |
Calcium chloride | Sigma | SLBJ2662V | None |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 030M0200 | None |
Sodium chloride | Sigma | SLBD2595V | None |
Mini-PROTEAN TGX Gels | Bio-Rad | 456-1093 | None |
ATGL primary antibody (from rabbit) | Cell Signaling | 2138S | None |
Secondary anti body (anti rabbit) | LI-COR | 926-68071 | None |
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer | Boston BioProducts | D25Y6Z | None |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | RNBD2893 | None |
Trypsin | Gibco | 25200-056 | None |
Cortizone 10 anti-itch ointment | Cortizone 10 | C4029138 | None |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | None |
Newborn calf serum (CS) | Sigma | N4762 | None |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | None |
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I0516 | None |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | None |
Insulin (bovine) | Sigma | I5879 | None |
Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693159001 | None |