Encapsulation תרמוגנית Preadipocytes להשתלה לבסיס מיון רקמת שומן

Summary

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Abstract

אנקפסולציה התא פותחה כדי ללכוד תאי קיימא בתוך ממברנות חדירות למחצה. Engrafted התאים במארז יכולים להחליף מטבוליטים משקל מולקולריים נמוכים ברקמות של המארח טופל להשיג הישרדות לטווח ארוך. ממברנה חדירה למחצה מאפשרת engrafted תאים במארז, כדי למנוע דחייה על ידי המערכת החיסונית. הליך אנקפסולציה נועד לאפשר שחרור מבוקר של תרכובות ביו, כגון אינסולין, הורמונים אחרים, וציטוקינים. כאן אנו מתארים שיטה לאנקפסולציה של תאי קטבולי, אשר צורכים שומנים לייצור חום ופיזור אנרגיה (thermogenesis) ברקמת השומן תוך-בטני של עכברים שמנים. Encapsulation של תאי קטבולי התרמוגני עשוי להיות פוטנציאל החלים על המניעה וטיפול בהשמנת יתר וסוכרת מסוג 2. יישום אפשרי נוסף של תאי קטבולי עשוי לכלול סילוק רעלים מאלכוהול או מטבוליטים רעילים אחרים ומזהמים סביבתיים.

Introduction

שכיחות גוברת של מחלות כרוניות ¹ עוררה מחקרים על השתלה של אוכלוסיות תאים טיפוליות ^2. תאי גזע Syngenic או אלוגנאית הם סוגי התאים הנפוצים ביותר עבור יישומים אלה ^2. עם זאת, טיפולים אלה אינם מאפשרים שליטה של ​​בידול והגירה של תאי גזע לאחר השתלה ולא יעלו יעיל. השתלה של תאים מהונדסים גנטי עם פונקציות מועילות צופה שיפור הטיפול במחלות רבות. עם זאת, שינויים גנטיים תא מוכרים על ידי המערכת החיסונית של המארח, ולכן, טיפולים אלה מחייבים דיכוי חיסוני ^3. Encapsulation של תאים מייצרים אינסולין פותח על ידי ד"ר ⁴ צ'אנג. הטכניקה מבוססת על אנקפסולציה של תאים בטיפות אלגינט ששקועים בפתרון סידן כלורי. מולקולות אלגינט מורכבות מחומצת mannuronic (M) וguluronic (G) ויכולות להיות מחוברות על ידי Ca ^{2 +}. לאחר gelation, חרוזים מושעים פתרון פולי-L ליזין (PLL). במהלך שלב זה, PLL נקשר לG ו- M במולקולות אלגינט הקובעת קרום של הכמוסה. הנקבוביות של הקרום של הכמוסה יכולה להיות מווסת על ידי שינוי ריכוזי M וPLL, זמן הדגירה, וטמפרטורה. המחייב של PLL גם תלוי בסוג והריכוז של אלגינט. מטריצות אלגינט crosslinked עם Ca ^{2 +} יונים, אינן יציבים בסביבה הפיזיולוגית או בפתרונות חיץ משותפים עם ריכוז גבוה של פוספט ויונים ציטראט. מאגרים אלה יכולים לחלץ Ca ^{2 +} מאלגינט ונוזל הליבה. עיבוי של ליבת אלגינט מספק מרחב בתוך קפסולות לתנועה וצמיחה תאיות. תאים במארז באלגינט polyanionic עם פולי-L ליזין polycationic (APL) הם בלתי חדירים לנוגדנים אבל יש לי זרם של חומרים מזינים וזרימה של רעלים. המאפיינים של APL אלה מאפשרים לטווח הארוך survival של תאים במארז לאחר השתלה למארחים שונים מבחינה גנטית. אליוט et al. דיווח ההישרדות של תפקוד תאי לבלב חזירי במארז במטופל אנושי תשע שנים לאחר ההשתלה ^5.

טכניקות Encapsulation ניתן לסווג למיקרואנקפסולציה (3-800 מיקרומטר) וmacroencapsulation (גדול יותר מ -1,000 מיקרומטר). Microcapsules עמיד יותר מאשר macrocapsules ^6. מאז גילויו על ידי ד"ר צ'אנג ועמיתים בשינה 1964, מיקרואנקפסולציה כבר בשימוש נרחב לאנקפסולציה של תאים אנבוליים ייצור אינסולין, הורמונים אחרים, ומולקולות ביו ^7. טיפולים אלה בפני מספר אתגרים ברקמת המארח כולל סיסטיק ותגובה חיסונית ^8. בתחילה, תופעות לוואים הקשורות לאיכות biopolymers נפתרו. עם זאת, השתלה של תאים אנבוליים עדיין יוזמת תופעות לוואי, כגון סיסטיק, כתוצאה מההורמון overproduction מחוץ לבלוטה מיוחדת.

בעשורים האחרונים, השמנת יתר וסוכרת מהסוג 2 הגיעה לממדי מגיפה ^9. יותר מ -30% מאנשים בוגרים בעולם סובלים מעודף משקל והשמנת יתר ^10. היווצרות מוגברת תוך-בטני (IAB) שומן מגבירה שכיחות של דלקת כרונית ומקדמת סוכרת מסוג 2, מחלות לב וכלי דם, סוגי סרטן מסוימים, ותחלואות אחרות ^11-13. כמה שורות של ראיות מצביעים על כך פתוגנזה הקשורים שומן IAB ניתן נמנעה על ידי תאי שומן ספציפיים. מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי השתלה של תאי שומן תת עורי לאזור IAB יכול לשפר את חילוף חומרים וירידת התנגדות השמנה ואינסולין במכרסמים בvivo ^14. הפחתה אפקטיבית של התנגדות השמנה והאינסולין נקשרה עם adipocytes התרמוגני מסוגלים מתפוגג אנרגיה בצורה של חום ^15,16. שינוי התרמוגני של adipocytes יכול להיות מושגת על ידי transfection היציבשל גנים המשתתפים בשחרר פרוטון המיטוכונדריה, כגון החלבון שחרר 1 (Ucp1) או של גנים המסדירים ביטוי של Ucp1 וגנים התרמוגני אחרים ^15,16. המחקרים האחרונים שלנו הראו כי המחסור בA1 אלדהיד דהידרוגנז 1 (Aldh1a1) מוביל לשיפוץ התרמוגני של שומן IAB שמפחית השמנת יתר ועמידות לאינסולין בעכברים אלה ^17,18. יש לציין, אנקפסולציה של התרמוגני Aldh1a1 הלקוי (Aldh1a1 – / -) preadipocytes מתווכת אותו אפקט טיפולי בשומן IAB בעכברים שמנים מסוג בר, מציעה הזדמנויות טיפוליות חדשות לטיפול בשומן IAB ^18. בהגדרות ניסוי, תאים במארז מאפשרים לחוקרים ללמוד השפעות של אוכלוסיות תאים ספציפיות בעלות אופן יעיל ^19. כאן אנו דנים בשיטה של ​​אנקפסולציה של שורת תאי קטבולי התרמוגני והמעבדה שלו ויישום טיפולי במודל עכבר של השמנת יתר. הפרוטוקול מתאר tשלבי HREE לייצור microcapsule (איור 1): ההיווצרות של microbeads אלגינט (איור 1 א), ההיווצרות של פולי-L ליזין polycationic (PLL) קרומים על פני השטח של microbeads (איור 1), והסרת ליבות אלגינט (איור 1 ג).

Protocol

פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה באוניברסיטת מדינת אוהיו. ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי פרוטוקול IACUC. כל הנהלים בוצעו תחת ממשלת רמת הבטיחות הביולוגית 2 עם זרימה למינרית. עקבנו אחרי כל דרישות הבטיחות סטנדרטית ונהלים. טכניקת מיקרואנקפסולציה להכנת microcapsules שבוצע?…

Representative Results

איור 1 מראה כי בכל שלב של ייצור microbeads יכול להיות נשלט מתחת למיקרוסקופ. איור 2A מראה כיצד התרבות משותפת adipocytes עם monolayer של תאים במארז. איור 2 היא דוגמא מייצגת של מחקר כמותי באמצעות adipocyte / שיתוף תרבויות microcapsules ש תוארו בסעיף 5. Lysates של adipocytes נותחו ב?…

Discussion

שיטות שונות שימשו כדי לתמצת תאים, כולל ייבוש, חול, ותחליב ^19. בשיטה זו, נמתחים חרוזים אלגינט באמצעות מחט, אז מצופים PLL וליבת אלגינט תפורק כדי להשלים את אנקפסולציה. למרות ששיטה זו הייתה בשימוש כבר שנים, היווצרות של חרוזים עם הגודל הרצוי וצורה כדורית היא עדיין מאתגרת…

Materials

Encapsulation device (VAR V1)	Nisco	LIN-0042	None
KD scientific syringe pump	KD scientific	780100Y	None
Olympus microscope	Olympus Optical	IX70-S8F2	None
Sodium alginate	Sigma	MKBP8122V	None
Poly-l-lysine hydrobromide (PLL)	Sigma	020M5006V	None
Calcium chloride	Sigma	SLBJ2662V	None
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma	030M0200	None
Sodium chloride	Sigma	SLBD2595V	None
Mini-PROTEAN TGX Gels	Bio-Rad	456-1093	None
ATGL primary antibody (from rabbit)	Cell Signaling	2138S	None
Secondary anti body (anti rabbit)	LI-COR	926-68071	None
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer	Boston BioProducts	D25Y6Z	None
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	RNBD2893	None
Trypsin	Gibco	25200-056	None
Cortizone 10 anti-itch ointment	Cortizone 10	C4029138	None
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-092	None
Newborn calf serum (CS)	Sigma	N4762	None
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F4135	None
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I0516	None
Dexamethasone	Sigma	D4902	None
Insulin (bovine)	Sigma	I5879	None
Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	4693159001	None