Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.
Сотовый инкапсуляции была разработана для улавливания жизнеспособных клеток в полупроницаемых мембран. Насаждаемое инкапсулированные клетки могут обмениваться низкие метаболитов молекулярным весом в тканях обрабатываемой хозяина для достижения долгосрочного выживания. Полупроницаемую мембрану позволяет привиты инкапсулированные клетки, чтобы избежать отторжения иммунной системой. Процедура инкапсуляции была разработана для того, чтобы контролируемое высвобождение биологически активных соединений, таких как инсулин, других гормонов, и цитокинов. Здесь мы опишем метод инкапсуляции для катаболических клеток, которые потребляют липидов для производства тепла и диссипации энергии (термогенез) в внутрибрюшного жировой ткани у мышей с ожирением. Инкапсуляция термогенных катаболических клеток может быть потенциально применимы для предупреждения и лечения ожирения и диабета 2 типа. Другое потенциальное применение катаболических клеток может включать в себя детоксикации от спиртов или других токсичных метаболитов, загрязнителей окружающей среды.
Увеличение заболеваемости хроническими болезнями 1 стимулировало исследования по трансплантации терапевтических клеточных популяций 2. Сингенные или аллогенных стволовых клеток являются наиболее часто используемые типы клеток для этих приложений 2. Тем не менее, эти процедуры не позволяют контролировать дифференциации и миграции стволовых клеток после имплантации и не рентабельным. Трансплантация генетически модифицированных клеток с выгодных функций предвидит улучшения лечения многих заболеваний. Тем не менее, генетические модификации клеток признаны иммунной системы хозяина, следовательно, эти процедуры требуют иммуносупрессии 3. Инкапсуляция клеток, продуцирующих инсулин был разработан доктором Чанг 4. Методика основана на инкапсуляции клеток в альгинатных капель, которые погружают в раствор хлорида кальция. Альгинатные молекулы состоят из маннуроновой (М) и гулуроновой кислоты (G), и может быть подключен с помощью Ca 2+, После желатинизации, гранулы суспендируют в поли-L-лизин (PLL) раствора. Во время этого этапа ФАПЧ связывается с G и М в молекулах альгината, который устанавливает мембрану капсулы. Пористость оболочки капсулы можно модулировать путем изменения концентрации М и PLL, времени инкубации и температуры. Связывание PLL также зависит от типа и концентрации альгината. Альгинатные матрицы, сшитый Са 2+, неустойчивы в физиологической среде или в общих буферных растворов с высокой концентрацией фосфата и цитрата ионов. Эти буферы могут извлечь Ca 2+ из альгината и жидкое ядро. Сжижение альгината ядра обеспечивает пространство внутри капсулы для сотовых движения и роста. Клетки, инкапсулированные в альгинат полианионного с поликатионный поли-L-лизина (APL) непроницаемы для иммуноглобулинов, но есть приток питательных веществ и отток токсинов. Эти свойства позволяют APL на длительный срок суrvival инкапсулированных клеток после трансплантации в генетически различных хостов. Эллиот и др. Сообщили выживание функционирует инкапсулированные клетки поджелудочной железы свиньи у пациента-человека девять лет после имплантации 5.
Методы инкапсуляции могут быть классифицированы в микрокапсуляции (3-800 мкм) и макроинкапсулирование (больше, чем 1000 мкм). Микрокапсулы более долговечны, чем макрокапсулы 6. С момента своего открытия д-ра Чанга и коллегами в 1964 году, микрокапсулы широко используется для инкапсуляции анаболических клеток, продуцирующих инсулин, других гормонов и биологически активных молекул 7. Эти процедуры столкнулась с рядом проблем в принимающей ткани, включая фиброз и иммунного ответа 8. Первоначально побочные эффекты, связанные с качеством биополимеров были решены. Тем не менее, трансплантация клеток анаболических еще инициирует побочные эффекты, такие как фиброз, в результате гормональной overprкий ВВЕДЕНИ Е вне специализированного железы.
В последние десятилетия, ожирение и диабет типа 2 достигло масштабов эпидемии 9. Более 30% взрослых людей во всем мире имеют избыточный вес и ожирение 10. Увеличение внутрибрюшного (IAB) образование жира увеличивает частоту хронического воспаления и способствует сахарный диабет 2 типа, сердечно-сосудистые заболевания, некоторые виды рака и других заболеваемости среди 11-13. Несколько линий доказательств предположил, что патогенез связан с IAB жира может быть предотвращено путем конкретных адипоцитов. Последние исследования показали, что трансплантация подкожных адипоцитов в IAB области может улучшить обмен веществ и уменьшить ожирение и инсулинорезистентность у грызунов в естественных условиях 14. Эффективное снижение ожирения и резистентности к инсулину была связана с термогенный адипоцитов, способных рассеивать энергию в виде тепла 15,16. Термогенный модификация адипоцитов может быть достигнуто путем стабильной трансфекциигенов, участвующих в митохондриального протонного разобщением, таких как разобщение белка 1 (UCP1) или генов, регулирующих экспрессию UCP1 и других термогенных генов 15,16. Наши недавние исследования показали, что дефицит в альдегиддегидрогеназы 1 A1 (aldh1a1) приводит к термогенный ремоделирования IAB жира, что уменьшает ожирение и резистентность к инсулину у этих мышей 17,18. Следует отметить, что инкапсуляция термогенный aldh1a1 недостаточной (aldh1a1 – / -) преадипоциты опосредует же терапевтический эффект в IAB жира у тучных мышей дикого типа, что указывает новые терапевтические возможности для лечения IAB жира 18. В экспериментальных условиях, инкапсулированные клетки позволит исследователям изучать эффекты конкретных клеточных популяций в экономически эффективным образом 19. Здесь мы обсуждаем метод инкапсуляции термогенного катаболического клеточной линии и ее лаборатории и терапевтического применения в мышиной модели ожирения. Протокол описывает три фазы для производства микрокапсул (рис 1): формирование альгината микросфер (рис 1А), формирование поликатионного поли-L-лизина (PLL) мембран на поверхности микросфер (рис 1B), и удаления альгината ядра (рис 1в).
Различные методы были использованы для инкапсуляции клеток, в том числе сушки, экструзии, и эмульсии 19. В этом методе, альгината шарики подвергают экструзии через иглу, затем покрывают ФАПЧ и альгинат сердечника будет растворено, чтобы завершить инкапсуляции. Хотя этот метод был ?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Дженнифер Петрозино и Дэвид DiSilvestro для редакционного помощи. Это исследование было поддержано Award Количество 20020728 от американского Совета яйцо и премии Количество 10040042 от Ново Нордиск Pharmaceuticals, а также Инновационного центра пищевых продуктов, Бюро по международным делам, Центр перспективных исследований Foods функциональной и предпринимательству при ОГУ, а также Национальный научный фонд предоставить ЕЕС-0914790 (LJL). Проект описывается поддержали Award Количество R21OD017244 (OZ) и UL1RR025755 (OSUCCC) из Национального центра по исследованию ресурсов, финансируется Управлением Директор Национальных Институтов Здоровья (OD) при поддержке НИЗ для медицинских исследований и NCI P30CA16058. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального центра исследовательских ресурсов или Национального института здравоохранения.
Encapsulation device (VAR V1) | Nisco | LIN-0042 | None |
KD scientific syringe pump | KD scientific | 780100Y | None |
Olympus microscope | Olympus Optical | IX70-S8F2 | None |
Sodium alginate | Sigma | MKBP8122V | None |
Poly-l-lysine hydrobromide (PLL) | Sigma | 020M5006V | None |
Calcium chloride | Sigma | SLBJ2662V | None |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 030M0200 | None |
Sodium chloride | Sigma | SLBD2595V | None |
Mini-PROTEAN TGX Gels | Bio-Rad | 456-1093 | None |
ATGL primary antibody (from rabbit) | Cell Signaling | 2138S | None |
Secondary anti body (anti rabbit) | LI-COR | 926-68071 | None |
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer | Boston BioProducts | D25Y6Z | None |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | RNBD2893 | None |
Trypsin | Gibco | 25200-056 | None |
Cortizone 10 anti-itch ointment | Cortizone 10 | C4029138 | None |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | None |
Newborn calf serum (CS) | Sigma | N4762 | None |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | None |
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I0516 | None |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | None |
Insulin (bovine) | Sigma | I5879 | None |
Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693159001 | None |