عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين

Summary

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Abstract

التسامح المناعي في الحمل يتطلب أن النظام المناعي للأم يخضع لتغيرات مميزة من أجل قبول ورعاية الجنين. يبدأ هذا التسامح أثناء الجماع، أنشأ خلال تلقيح والزرع، وحافظت طوال فترة الحمل. يتم إثراء وسطاء الخلوية والجزيئية النشطة التسامح الأم والجنين في موقع التماس بين أنسجة الجنين والأم، والمعروفة باسم واجهة الأم والجنين، والذي يتضمن المشيمة والرحم والأنسجة الساقطية. وتتألف هذه الواجهة من خلايا انسجة والكريات البيض التسلل، ووفرة والمظهرية خصائصها تتغير على مدى فترة الحمل. وتشمل التسلل الكريات البيض في واجهة الأم والجنين العدلات، الضامة، والخلايا الجذعية، الخلايا البدينة، وخلايا T والخلايا B والخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا NKT التي تخلق معا المحلية الصغيرة للبيئة التي تحافظ على الحمل. اختلال التوازن بين هذه الخلايا أو أي inappropيعتبر تغيير riate في الظواهر التي آلية المرض في فترة الحمل. ولذلك، فإن دراسة الكريات البيض التي تتسلل إلى واجهة الأم والجنين أمر ضروري من أجل توضيح الآليات المناعية التي تؤدي إلى مضاعفات متعلقة بالحمل. الموصوفة هنا هو البروتوكول الذي يستخدم مزيجا من التفكك الميكانيكية لطيف تليها تصنيف الأنزيمية قوية مع بروتين وحال للكولاجين كوكتيل الأنزيمية لعزل الكريات البيض التسلل من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين. هذا البروتوكول يسمح لعزل أعداد كبيرة من الكريات البيض قادرة على البقاء (> 70٪) مع خصائص المستضدات وظيفية الحفظ بما فيه الكفاية. ومن ثم يمكن تحليلها الكريات البيض معزولة من قبل العديد من التقنيات، بما في ذلك المناعي، فرز الخلايا، والتصوير، immunoblotting، مرنا التعبير، زراعة الخلايا، وفحوصات في المختبر وظيفية مثل ردود فعل متباينة الكريات البيض، والانتشار، أو فحوصات السمية الخلوية.

Introduction

التسامح المناعي في الحمل هي فترة عندما تحدث تغيرات مميزة في الجهاز المناعي للأم. هذه التغييرات تسمح الأم لتحمل الجنين، والكسب غير المشروع شبه الصنعية ^1. الجنين يعبر عن الأب معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) المستضدات ^2، وقد تم العثور على خلايا الجنين في الدورة الدموية للأم ^3. ومع ذلك، لا يتم رفض الجنين ^4،5. ليست مفهومة تماما هذا اللغز.

تنص الفرضية الأخيرة أن التسامح الأم والجنين يتم إنشاؤه أثناء الجماع وتلقيح ^6،7 وصيانتها للحفاظ على الحمل فترة ولاية كاملة ^10/08. ويعتبر توزيع لهذا التسامح الأم والجنين آلية المرض خلال المراحل المبكرة والمتأخرة من الحمل ^10-16. التسامح الأم والجنين ينطوي على مشاركة مختلف المجموعات الفرعية من السكان الكريات البيض، بما في ذلك خلايا T (خلايا T التنظيمي، وخلايا TH1 الخلايا TH2، وخلايا Th17)، لجنة الهدنة العسكريةrophages، العدلات، الخلايا البدينة، الخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا NKT، والخلايا الجذعية، والخلايا B، أن التغير في كثافة وتوطين طوال فترة الحمل ^15،17-19. غير المخصب التسامح الأم والجنين على الأم والجنين واجهة ²⁰ – الموقع التشريحي حيث يتفاعل الجهاز المناعي للأم مع الجنين مستضدات ^20،21.

يتم إنشاء واجهة الأم والجنين خلال المشيمة عندما خلايا الأرومة الغاذية extravillous الجنين تغزو الغشاء المخاطي في الرحم ^22-24. على الجانب الجنين من هذه الواجهة، والأغشية المحيطة بالجنين إنشاء سطح الظهارية المتخصصة في المشيمة، وخلايا الأرومة الغاذية المخلوية السيطرة على صرف المواد الغذائية من خلال الاتصال المباشر مع دم الأم ^(22). على الجانب الأمهات واجهة، والساقط المجندين تجمع غير متجانس من الكريات البيض التي في الفئران تمثل 30٪ إلى 50٪ من جميع الخلايا الساقطية. بالإضافة إلى مشاركتهم في maternآل التسامح المناعي، وهذه الخلايا هي من أهم المساهمين في عمليات مختلفة خلال فترة الحمل، على سبيل المثال، حماية الجهاز التناسلي من الالتهابات والتلقيح، زرع الجنين ^7،25، الأوعية الدموية ساقطي ^26، إعادة الأوعية الدموية ^24،27، غزو الأرومة الغاذية ^28، المشيمة التنمية ^24،25، وفي نهاية المطاف والمخاض والولادة ^15،17. ولذلك، فإن دراسة الكريات البيض تشارك في التسامح الأم والجنين ضروري لتوضيح التسبب في مضاعفات مرتبطة بالحمل.

في حين أن استخدام المناعية والمناعي ولدت البيانات لرؤية مباشرة وتوطين الرحم، ساقطي، أو الكريات البيض المشيمة ^29،30، تحليل التدفق الخلوي وكذلك كشفت مجموعات فرعية محددة من الكريات البيض في كل من هذه الأنسجة ^31،32. بالإضافة إلى ذلك، التدفق الخلوي قد استخدمت لتحديد الكثافة ونسبة الأمنال والجنين واجهة الكريات البيض ³³ و التعبير مستويات بروتينات الخلية والخلايا ^8-10،34. تحليل تدفق cytometric من الكريات البيض في واجهة الأم والجنين يتطلب تعليق وحيد الخلية. من أجل عزل الكريات البيض التسلل من ساقطي، الرحم، والأنسجة المشيمية، وقد استخدمت طريقتين للتفكك النسيج: الميكانيكية والأنزيمية. كلتا الطريقتين تسمح للفصل الكريات البيض تسللوا من المصفوفة خارج الخلية (ECM) من هذه الأنسجة. تفكك النسيج الأنزيمية متفوقة على تفكك النسيج الميكانيكية لأنها تسمح عائدات أعلى من الكريات البيض مع الأضرار المرتبطة القص قوة أقل ^35. ونتيجة لذلك، تفارق الأنسجة الميكانيكية يتطلب إلى التجميع الأنسجة ^36، والتي قد تزيد من التباين والتغاير من العينات. بعد ذلك، قد يكون التفكك الميكانيكية الخيار عندما يكون المستضد من الفائدة يمكن أن تتغير من التفكك الأنزيمية أو عند وظيفة الخليةأن الحفاظ على الصورة الحاجة الفائدة (على سبيل المثال، السمية الخلوية للخلايا NK) ^35.

استخدام التحلل البروتيني مع إنزيمات معينة لتدهور ECM يلغي العائدات المنخفضة لاحظ مع التفكك الميكانيكية. وأفادت العديد من الدراسات أن استخدام التربسين ^32، كولاجيناز ^37، الدناز ^31، dispase ^38، والكوكتيلات التجارية من الإنزيمات المختلفة ^32،39. ومع ذلك، فإن طبيعة وتركيز الإنزيمات المختلفة ومدة الهضم يجب تحديدها بدقة والتأكد من صلاحيتها لضمان الحفاظ على سلامة الحواتم المستضدية سطح الخلية المطلوبة لالمناعي. الهياكل سطح مختلف عرضة بشكل مختلف لتدمير الإنزيمات المختلفة، مع بعض الإنزيمات، مثل التربسين، كونها سيئة السمعة لتجريد الحواتم سطح الكريات البيض معترف بها من قبل العديد من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة.

قدم هنا هو طريقة استخدام proteolytجيم وكوكتيل الأنزيمية حال للكولاجين، ودعا Accutase. هذا الحل الأنزيمية هو لطيف بما فيه الكفاية في حين لا يزال فعالا في الفصل بين أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين، و لا يتطلب إضافة الكواشف النأي أخرى أو مصل لإنهاء رد فعل التفكك. وعلاوة على ذلك، وانها مستعدة لاستخدام الموردة و، على الرغم من أن الوقت من التفكك يحتاج إلى التحقق، وهو أكثر قوة من الانزيمات المشار إليها أعلاه ^40،41.

استخدام مزيج من كلا النوعين من تصنيف الأنسجة يحسن نوعية وكمية من الخلايا التي تم الحصول عليها. وبالتالي، العديد من الدراسات قد نفذت الجمع بين استخدام تفارق الميكانيكية والأنزيمية مع نتائج مرضية ^31،32،37. تأسست بروتوكول صفها هنا والتحقق من صحتها في مختبرنا. يستخدم مزيج من التفكك الميكانيكية لطيف تليها تصنيف الأنزيمية القوي. يسمح هذا البروتوكول الدراسة العزلة ومزيد منالكريات البيض التسلل في أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين (الرحم، الساقط، والمشيمة). يحافظ على بروتوكول التالية أيضا على سلامة علامات سطح الخلية وعوائد خلايا قابلة للحياة بما فيه الكفاية لتطبيقات المصب كما يتبين من تحليل تدفق cytometric. أخيرا، ويحافظ على هذا البروتوكول اتساق إعداد الخلايا لتحليل ومقارنة أنسجة الفئران مختلفة تتكون واجهة الأم والجنين.

Protocol

قبل العمل مع العينات المشار إليها في هذا البروتوكول، ويجب أن تعطى الموافقة الأخلاقية الحيوانية من خلال لجنة أخلاقيات البحوث المحلية ومجالس المراجعة المؤسسية. عند العمل مع دم الحيوانات والخلايا، أو العوامل الخطرة كما ذكر في هذا البروتوكول، يجب أن يتبع الإجراءات الم…

Representative Results

يظهر تشريح الأنسجة الفئران من واجهة الأم والجنين في الشكل 1؛ ويشمل هذا الإجراء فتح التجويف البريتوني (الشكل 1A، B)، وأبواق الرحم (الشكل 1C) بما في ذلك مواقع زرع (الشكل 1D)، وجمع من أنسجة الرحم (الشكل 1E)، المشيمة (الشكل 1F)،</str…

Discussion

جمع البيانات متسقة أن يسجل وفرة والمظهرية خصائص الكريات البيض التسلل في واجهة الأم والجنين ضروري لفهم التسبب في مضاعفات مرتبطة بالحمل. وقد وصفت العديد من التقنيات التي تسهل عزل التسلل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين طوال فترة الحمل ^{31،38،39،43-46….}

Materials

			Magentic Cell Separation
MS Columns
Cell Separator
30μm pre separation filters
Multistand
15mL safe lock conical tubes
MACS Buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
Anti-mouse CD16/CD32
Anti-mouse extracellular antibodies			(Table 1)
Sodium azide
Bovine serum albumin			(BSA)
LIVE/DEAD viability dye
Fixation buffer solution
FACS Buffer			(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)
Trypan Blue Solution 0.4%
Fetal bovine serum
			Additional Instruments
Incubator with shaker
Flow cytometer
Centrifuge
Vacuum system
Incubator
Water bath
Cell counter
Microscope